[发明专利]一种鱼用DNA疫苗及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种鱼用DNA疫苗，其特征在于：

所述的鱼用DNA疫苗为含有Z-DNA序列的重组质粒与含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒的混合物；其中所述的含有Z-DNA序列的重组质粒与所述的含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒之间的质量比为1：1；

所述的含有Z-DNA序列的重组质粒的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的鱼用DNA疫苗，其特征在于：

所述的Z-DNA序列通过人工合成来获取；

所述的PKZ开放阅读框序列通过PCR扩增来获取。

3.根据权利要求2所述的鱼用DNA疫苗，其特征在于：

所述的含有Z-DNA序列的重组质粒通过将Z-DNA序列插入到真核表达载体上来获取；

所述的含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒通过将PKZ开放阅读框序列插入到真核表达载体上来获取；

所述的真核表达载体为含有Flag标签的真核表达载体。

4.根据权利要求3所述的鱼用DNA疫苗，其特征在于：

所述的含有Flag标签的真核表达载体为pCMV-Flag。

5.一种鱼用DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建含有Z-DNA序列的重组质粒：在Poly (GC)₁₀的一端添加Hind III限制性内切酶位点，其另一端添加Kpn I限制性内切酶位点，将添加限制性内切酶位点的Poly (GC)₁₀用退火缓冲液并经95℃处理30min，然后自然冷却至室温形成双链DNA，接着将pCMV-Flag质粒与退火后的Poly (GC)₁₀分别经Hind III限制性内切酶与Kpn I限制性内切酶的双酶切反应，回收产物，利用T4 DNA连接酶将双酶切后的Poly (GC)₁₀连接至pCMV-Flag质粒上，最后提取pCMV-Flag-GC重组质粒；

（2）构建含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒：获取含有酶切位点的草鱼PKZ开放阅读框的基因序列，设计并合成特异性引物，取草鱼cDNA模板，进行PCR扩增，得到草鱼PKZ开放阅读框的全长基因序列，接着通过将pCMV-Flag质粒与草鱼PKZ开放阅读框的全长基因序列分别经EcoR I限制性内切酶与Kpn I限制性内切酶的双酶切反应，回收产物，利用T4 DNA连接酶将双酶切后的PKZ开放阅读框序列连接至pCMV-Flag质粒上，最后提取pCMV-Flag-PKZ重组质粒；

（3）将步骤（1）构建的含有Z-DNA序列的重组质粒与步骤（2）构建的含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒，进行混合，即可。

6.根据权利要求5所述的鱼用DNA疫苗的制备方法，其特征在于：

其中构建含有Z-DNA序列的重组质粒的步骤中：

退火缓冲液的浓度为1倍。

7.根据权利要求5所述的鱼用DNA疫苗的制备方法，其特征在于：

其中构建含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒的步骤中PCR扩增反应体系如下：

草鱼cDNA模板2 µl，上下游引物各0.5 µl，LA Taq DNA聚合酶1 µl，Taq酶buffer 2.5µl，ddH₂O补至50 µl。

8.根据权利要求5所述的鱼用DNA疫苗的制备方法，其特征在于：

其中构建含有PKZ开放阅读框序列的重组质粒的步骤中PCR扩增反应条件如下：

95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10 min。

9.一种鱼用DNA疫苗在草鱼养殖中GCRV病毒感染防治的应用。

10.根据权利要求9所述的鱼用DNA疫苗在草鱼养殖中GCRV病毒感染防治的应用，其特征在于：

所述的鱼用DNA疫苗通过腹腔注射方式给药，给药浓度为30 µg-50 µg/尾。