[发明专利]一种集诊疗于一体的多功能纳米药物载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种集诊疗于一体的多功能纳米药物载体及其制备方法和应用。本发明的一种集诊疗于一体的多功能纳米药物载体，所述的多功能纳米药物载体由如下结构组成：八面体形DNA折纸、microRNA检测器、基因治疗药物(siRNA)和化学治疗药物(阿霉素Dox)。本发明选用三维DNA折纸作为载体，在折纸的bundle上面设计多个位点以连接药物或检测链，其中在腔室内设计了48个位点连接siRNA，对siRNA有更好的保护功能，在腔室外设计了24个位点连接检测器，与细胞质中的目标物microRNA更充分接触；负载两种药物，同时携带检测器，集癌症诊疗功能于一体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种集诊疗于一体的多功能纳米药物载体及其制备方法和应用。

背景技术

DNA折纸具有诸多优点，如化学性质稳定；有良好的生物相容性、编程性和可寻址性；刚性强；尺寸可控；能够抵抗多种核酸酶；可修饰性强；不用转染试剂即可进入细胞等等，因此近年来被广泛用于多领域的研究，尤其是载药领域。在这方面已有很多相关的工作。丁宝全课题组已得到了很多成果，首先，他们采用二维三角片形DNA折纸作为药物载体，抗癌药物阿霉素Dox通过插入到鸟嘌呤G-胞嘧啶C碱基对中完成负载，此载体能有效进入细胞并发挥药效(文章：J.Am.Chem.Soc.2012，134(32)，13396—13403.)，后他们又利用DNA折纸的强可寻址性和可修饰性，开发出了一系列的复杂药物载体，如携带肿瘤疫苗的酸响应型折纸载体(文章：Nat.Mater.2021，20,421–430.)、同时负载基因治疗药物小干扰RNAsiRNA和化疗药物阿霉素Dox且响应谷胱甘肽GSH释放的折纸载体(文章：Angew.Chem.Int.Ed.2020,59,1–6.)。

DNA杂交具有强特异性，可以用于检测癌细胞中特异标志物，如微RNAmicroRNA，再巧妙的设计反应链的脚趾端toehold，可以将相对较弱的检测信号放大若干数量级。如，将链置换技术结合荧光共振能量转移FRET效应，可以通过荧光强度来表征目标链的浓度(文章：Adv.Funct.Mater.2018,1800490)。

发明内容

为了构建集癌症诊疗于一体的纳米粒子，本发明利用八面体形DNA折纸，此框架腔室大，刚性较强，可以同时负载基因治疗药物Bcl2小干扰RNABcl2siRNA和化学治疗药物阿霉素Dox并具有良好的保护功能；此外，还结合了链置换放大技术及FRET效应检测低浓度癌细胞标志物，搭建出一个癌症诊疗一体化的独特三维载体，既能对癌细胞内的低浓度标志物产生特异的强信号，还能同时通过化疗和基因治疗两种手段对癌细胞进行凋亡引导。

为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种集诊疗于一体的多功能纳米药物载体，所述的多功能纳米药物载体由如下结构组成：八面体形三维DNA折纸框架、在框架边bundle上往外伸出的连接链连接的microRNA检测器、在bundle上往内伸出的连接链连接的基因治疗药物Bcl2siRNA和嵌入bundle内的化学治疗药物阿霉素Dox。其中microRNA检测器是由修饰Cy5荧光基团和BHQ2猝灭基团的两条DNA链杂交而成，siRNA由sense链和antisense链两条RNA链杂交而成。

本发明所述的集诊疗于一体的多功能纳米药物载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)八面体形DNA折纸合成：将M13mp18 scaffold DNA长链和120根DNA staple链混合在Tris-乙酸缓冲液(1×TAE)、12.5mM醋酸镁(MgAc₂)溶液中，将混合液放进pcr仪，在一天内从95℃缓慢冷却到20℃，合成八面体形三维DNA折纸，浓度为10nM；

(2)八面体DNA折纸提纯：将500μl八面体折纸加到100kDa超滤管中，于离心机中离心，离心转速为3000rcf，离心时间为8min，离心结束后重复2-4次洗涤操作，即再加入1×TAE、12.5mM MgAc₂溶液补到初始体积，进行离心，目的是去除过量的staple并将八面体DNA折纸浓缩至20nM；