[发明专利]一种从蟾蜍毒素中制备蟾蜍二烯内酯的方法及其用途

说明书

本发明涉及一种从蟾蜍毒素中制备蟾蜍二烯内酯的方法及其用途，该方法以蟾蜍毒素为原料，先利用超临界流体萃取脂肪酸成分，脱脂之后的毒素再用PBS缓冲溶液低温搅拌提取蛋白，离心，然后将沉淀物用乙醇溶剂提取，减压浓缩回收溶剂，得到浸膏蟾蜍二烯内酯；并对其进行定性定量分析，结果显示含有9个蟾蜍二烯内酯类化合物主成分，同时总蟾蜍二烯内酯类成分含量高于85%，符合中药有效部位总提取物含量达到50%以上的要求。进行体外抗炎和抗肿瘤活性测定，实验结果表明，从蟾蜍毒素中提取蟾蜍二烯内酯类化合物对环氧化酶‑2表现出不同程度的活性，可用于制备抗炎药物。同时对人乳腺癌细胞MCF‑7、结肠癌细胞HT29和人宫颈癌细胞Hela表现出不同程度的细胞毒活性，可用于制备抗肿瘤药物。

技术领域

本发明涉及民族医药技术领域，具体涉及从蟾蜍毒素中制备蟾蜍二烯内酯的方法及其在药物制备中的应用。

背景技术

蟾蜍(学名：Bufo viridis)为蟾蜍科蟾蜍属的两栖动物，分布在欧洲大陆、亚洲和北非。在中国大陆，分布于西藏、新疆等地，常见于沼泽水坑、沙漠边缘绿洲以及半咸水。其生存的海拔上限为4500米。蟾蜍毒素存在于中华大蟾蜍、黑蟾蜍或同属其它种蟾蜍耳后及皮肤分泌的白色浆液中,主要成分有脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、华蟾蛛它灵、蟾蛛它灵、日本蟾蛛它灵、蟾蛛灵等。蟾蛛毒素具有强心、麻醉、解毒、止痛、开窍、醒神等药理作用,己被广泛应用于临床。近年来发现,含有蟾蛛毒素的中药制剂在体外能抑制多种肿瘤细胞生长,诱导白血病细胞分化。临床观察提示,含有蟾蛤毒素的中药制剂对肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、白血病等具有明显的抑制作用。

炎症为常见的基本的病理过程,炎症是机体对外界刺激的一种防御性反应,过度或持续的炎症反应可引起组织损伤和机能障碍。花生四烯酸代谢网络是炎症代谢网络中的一个核心网络, 当致炎因子入侵细胞时,磷脂被磷脂酶A2(PLA2)催化,发生花生四烯酸(AA)的炎症级联代谢,花生四烯酸主要的代谢途径是通过环氧酶(COX)的作用生成前列腺素(PGs),以及通过脂氧合酶 (LOX)的作用生成白三烯(LTs)两条路径。PGE2是PGs的一种,有极强的致炎作用,PGE2不仅能介导发热及疼痛发生,还可刺激炎症因子的产生。LTs是一种促炎症脂质介质,其在急性和慢性炎症、哮喘、过敏性炎症、类风湿性关节炎等疾病中都起着重要的作用。

在辅助因子(辅助因子)存在的情况下，环氧化酶-2使用其环氧化酶(COX)活性把花生四烯酸(Arachidonic Acid)等底物环氧化生成PGG2等中间产物，继而环氧化酶-2使用其过氧化物酶(peroxidase)活性把PGG2等中间产物催化生成PGH2等最终产物，同时把几乎没有荧光的环氧化酶-2探针(荧光探针)催化生成有强荧光的探针(Ex560/Em590)。这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测环氧化酶-2的酶活性。如果在反应中加入环氧化酶-2抑制剂(Inhibitor)，荧光的生成就会被抑制，荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出抑制剂的抑制效果。本反应生成的强荧光探针的最大激发波长为571nm，最大发射波长为585nm，推荐检测时的激发波长为560nm，发射波长为590nm。其基本原理：筛选环氧化酶-2抑制剂的原理荧光探针*表示催化生成的强荧光探针：

生物大分子药物，由于具有高活性、强特异性、低毒性和生物功能明确等特点越来越受到人们的重视，但人们对动物类中药的蛋白类大分子成分的研究还相对较少。近些年来，人们对使用天然来源的大分子，例如核酸和蛋白质的替代药物越来越感兴趣，它们广泛存在于自然界中，并与中药中的小分子次级代谢产物一起发挥有效作用。研究发现蟾蜍毒素里含有大量的蛋白多肽等大分子活性成分，能够最大程度的利用这些活性成分也至关重要。目前提取蟾蜍二烯内酯的方法都浪费或者破坏了蟾蜍里的蛋白多肽成分，使得本领域的技术人员迫切希望利用物料特性，开发一种改进的总蟾蜍二烯内酯有效部位的制备方法，同时又高效利用蟾蜍毒素里的蛋白多肽成分，丰富蟾蜍毒素的利用价值。

发明内容