[发明专利]一种Sec1基因敲除小鼠模型的sgRNA、构建方法及其应用

权利要求书

1.一种构建Sec1基因敲除小鼠模型的sgRNA，其特征在于，包括靶向Sec1基因的第4号外显子的第61个碱基处的sgRNA和靶向Sec1基因的第4号外显子的第1270个碱基处的sgRNA；

靶向Sec1基因的第4号外显子的第61个碱基处的sgRNA序列为：

gRNA1：CCTCTTCTTCGTGATTTTCGTGG；

靶向Sec1基因的第4号外显子的第1270个碱基处的sgRNA序列为：

gRNA2：GGCCTACCATTCGCTGCATCTGG。

2.一种基因敲除载体，其特征在于，将如权利要求1所述的双sgRNA重组入表达载体中，得到基因敲除载体。

3.一种Sec1基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用权利要求1所述的sgRNA与Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，一起注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内，获得嵌合体的F0代；对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配获得具有稳定基因型的F1代小鼠，筛选Sec1基因敲除的纯合子代，作为Sec1基因敲除小鼠模型。

4.一种Sec1基因敲除小鼠模型，其特征在于，由权利要求3所述方法构建而成。

5.权利要求4所述的Sec1基因敲除小鼠模型的鉴定方法，其特征在于，鉴定小鼠基因型的引物序列如下：

F1:5’-AGGTGACAGAAAGATTCAGAGGTAC-3’

R1:5’-GAGTGAGTGTGAGTGTGCTAGAAAC-3’

F1:5’-AGGTGACAGAAAGATTCAGAGGTAC-3’

R2:5’-AGTGCAAACAGCGTGGCATATTC-3’。

6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，野生型个体有1765/446bp的PCR产物，纯合敲除小鼠只有555bp的PCR产物，杂合个体则有三种产物。

7.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，采集鼠尾和脚趾提取基因组DNA为模板进行PCR鉴定。

8.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，PCR反应体系为：

9.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，PCR反应条件为：

10.权利要求4所述Sec1基因敲除小鼠模型在制备靶向雄性哺乳动物精子质量降低的药物中的应用。