[发明专利]一种Sec1基因敲除小鼠模型的sgRNA、构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种构建Sec1基因敲除小鼠模型的方法，属于生物技术领域。采用Cas9/sg RNA注射受精卵的方法构建Sec1基因大片段敲除的小鼠模型，鉴定出野生型小鼠、杂合型小鼠和纯合型小鼠并对其进行表型分析、病理学分析、敲除前后对个体的影响和对睾丸发育、生精能力以及精子品质的影响的测定，以及Sec1基因本身的功能和分子机制分析，以期为该基因相关数据的补充和对个体功能的影响的数据探究提供了新的依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Sec1基因敲除小鼠模型的sgRNA、构建方法及其应用。

背景技术

Sec1基因是小鼠中编码半乳糖2-L-focusyltransferase的三个基因之一，又名为Fut3和Fut10。这些基因在发育和组织特异性表达上有所不同(REF)。该基因被预测编码II型膜蛋白，该蛋白锚定在高尔基体中，通过在α(1,2)连接中添加末端焦点来控制α(1,2)聚焦碳水化合物的生成的最后一步。聚焦点化碳水化合物的生物功能被认为涉及细胞粘附和与微生物的相互作用。

Sec1、Fut1，Fut2基因编码在α1,2岩藻糖转移酶(α2FTS)，在哺乳动物基因组织，是参与α2岩氧化族聚糖结构的生物合成的酶。先前的研究表明，岩藻糖基化聚糖参与了许多生物和病理过程，包括信号转导，宿主微生物相互作用，组织发育，癌症进展和合成的ABH和Lewis组织血群抗原。此外，在哺乳动物中也确定了Fut1，Fut2和Sec1的广泛基因转换。

在猪上相关研究表明，FUT3可通过TβR(主要是TβI)岩藻糖基化修饰，影响P38信号和TGF-β/Smad途径而启动上皮间充质转换，促进结肠癌的转移。 FUT3的下调会降低岩藻糖基化抗原(Ley)的表达，促进细胞的粘附。

在人上的相关研究表明，FUT3基因编码α-(1，3/4)岩藻糖基转移酶，是合成Lewis组织血型所必需的。同时，与FUT2相似，FUT3基因多态性也被揭示对幽门螺杆菌感染发挥影响。另外，FUT3基因的研究在肠道疾病过程中(Huet al., 2014；Duell et al.,2015；DoNascimento et al.,2019)，也有部分研究关注FUT3对于肿瘤标志物的影响，对癌症的预后作用及癌细胞的相关运动机制等。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建Sec1基因敲除小鼠模型的方法，基于 CRISPR-Cas9基因敲除技术设计了Sec1^-/-小鼠模型，以此对研究对象提供新的依据。为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

一种构建Sec1基因敲除小鼠模型的sgRNA，包括靶向Sec1基因的第4号外显子的第61个碱基处的sgRNA和靶向Sec1基因的第4号外显子的第1270 个碱基处的sgRNA；

靶向Sec1基因的第4号外显子的第61个碱基处的sgRNA序列为：

gRNA1：CCTCTTCTTCGTGATTTTCGTGG；

靶向Sec1基因的第4号外显子的第1270个碱基处的sgRNA序列为：

gRNA2：GGCCTACCATTCGCTGCATCTGG。

本发明还提供一种基因敲除载体，将上述双sgRNA重组入表达载体中，得到基因敲除载体。

本发明还提供一种Sec1基因敲除小鼠模型的构建方法，采用上述sgRNA与 Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，一起注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内，获得嵌合体的F0代；对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0 代小鼠与野生型小鼠交配获得具有稳定基因型的F1代小鼠，筛选Sec1基因敲除的纯合子代，作为Sec1基因敲除小鼠模型。

本发明还提供一种Sec1基因敲除小鼠模型，由上述方法构建而成。