[发明专利]一种小鼠脂肪干细胞外泌体制备方法

说明书

本发明涉及一种小鼠脂肪干细胞外泌体制备方法，包括以下步骤：取对数生长的第3至6代的小鼠脂肪干细胞用含10％FBS的DMEM培养液培养，直到细胞密度达到70％‑80％，换用含10％无外泌体FBS的DMEM培养液继续培养45‑50小时，收集上清培养液，离心除去细胞和细胞碎片，再用100kDa分子量的超滤管于1500‑2500g下离心30min浓缩，将外泌体快速提取试剂加入到浓缩液提取，离心，收集小鼠脂肪干细胞外泌体。本发明的方法显著提高了小鼠脂肪干细胞外泌体的产量和提取效率，且避免了超速离心等外泌体提取方法费时费力、产量低及可能损坏外泌体结构并影响其生物活性的缺陷，所制备的脂肪干细胞外泌体能显著促进小鼠毛发生长。

技术领域

本发明涉及干细胞外泌体领域，具体地说，涉及一种小鼠脂肪干细胞外泌体制备方法。

背景技术

脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cell，ADSC)是一类存在于脂肪组织中，具有多向分化潜能的间充质干细胞。在体外和体内，ADSs均具有分化成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经元、血管内皮细胞、腱细胞等多种细胞系的潜能。

外泌体(Exosome)是一类能够被细胞分泌到细胞培养上清中、具有脂质双分子层结构、直径为30-150nm的细胞外囊泡。外泌体含有多种蛋白质、核酸(miRNA，mRNA，lncRNA，circRNA)和脂质等成分，是细胞间通讯的重要载体，几乎所有细胞均可释放外泌体。

外泌体应用广泛，能够用于多种疾病治疗，副作用小，减少人体排斥反应。

现有技术公开了一些制备脂肪干细胞外泌体的方案。如专利文献CN110938593A公开了一种鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体提取方法，按照以下步骤实施：步骤1，收集鳄鱼脂肪干细胞；步骤2，对步骤1收集到的鳄鱼脂肪干细胞在无血清培养基中进行培养，取上清液超高速离心，沉淀物即为鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体。其中步骤2中将收集到的鳄鱼脂肪干细胞在无血清培养基中进行培养，具体方法为：将鳄鱼脂肪干细胞加入到无血清培养基中，培养5～8天，每天收集上清液，并更换新鲜的培养基。步骤2中超高速离心的具体步骤为：a.将经过无血清培养基培养收集的上清液在4～6℃下，以300～400g离心10～15min，留上清液，弃去沉淀；b.将a步骤所得上清液在4～6℃下，以1800～2500g离心10～20min，留上清液，弃去沉淀；c.将b步骤所得上清液在4～6℃下，以10000～12000g离心25～30min，留上清液，弃去沉淀；d.将c步骤所得上清液在4～6℃下，以100000～150000g离心65～75min，弃去上清液，保留沉淀；e.将d步骤所得沉淀采用PBS缓冲溶液进行重悬，然后再在4～6℃下，以100000～150000g离心65～75min，弃去上清液，保留沉淀，即得鳄鱼脂肪干细胞来源外泌体。另外专利文献CN110396497A公开了一种自体脂肪干细胞外泌体的制备方法，包括步骤：一、脂肪干细胞的制备：在GMP制备车间中，150毫升自体脂肪组织放入3个50毫升离心管中，分别加入10毫升的3mg/ml的胶原蛋白酶I和5毫升的0.25％胰酶消化180分钟，再加入血清的DMEM/F12培养基终止消化、离心、弃掉上清，在细胞沉淀中加入20毫升无血清细胞培养基中培养，每5天换液，第15-20天，观察到梭形细胞长出，7-8个克隆的时候可以传代、冻存；二、脂肪干细胞外泌体的富集：取对数期细胞，2000转离心，去上清；加入胰酶消化、离心、去上清，加入不含血清替代物的培养基1:10传代，5天以后，收集所有上清，10000转高速离心，取沉淀，检测，冻存。

然而，现有的外泌体制备方案有较多缺陷，如超速离心法需要专业设备、费时费力、可能损坏外泌体结构并影响其生物活性，试剂盒法获得外泌体产量低等。此外，分泌外泌体的细胞种类、状态和外泌体提取过程中的操作均影响外泌体的产量和提取效率以及质量。鉴于现有技术的缺陷，有必要开发一种产量高、速度快、产物具备良好生物活性的小鼠脂肪干细胞外泌体(ADSC-Exo)制备方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种小鼠脂肪干细胞外泌体制备方法。