[发明专利]一种鉴别勃氏牡丹的引物、试剂、鉴别方法及试剂盒

说明书

本发明涉及鉴别领域，特别是涉及濒危野生动植物的鉴别领域，更为具体的说是涉及一种鉴别勃氏牡丹的引物、试剂、鉴别方法及试剂盒，通过对岩牡丹属植物进行转录组测序和分析，发现勃氏牡丹与其他的岩牡丹属植物相比较，在PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)功能基因序列上存在11个碱基的突变位点。进一步筛选其中的9个碱基的突变位点进行设计，从而获得勃氏牡丹的实时荧光定量PCR的特异性引物和荧光探针，用于研究勃氏牡丹的分子鉴别方法，并检测该方法的灵敏度，为濒危物种的鉴别提供新的技术路线。

技术领域

本发明涉及鉴别领域，特别是涉及濒危野生动植物的鉴别领域，更为具体的说是涉及一种鉴别勃氏牡丹的引物、试剂、鉴别方法及试剂盒。

背景技术

勃氏牡丹Ariocarpus bravoanus属仙人掌科岩牡丹属，原产墨西哥。勃氏牡丹在世界自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录中被评为“濒危”级别，同时被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(简称为《公约》)。

对于勃氏牡丹的鉴别目前仍以形态学为主，而生态学鉴别对于专业鉴别人员的依赖性很重，这就导致各海关口岸无法在鉴别过程中需要配备大量的形态鉴别专家。人才短缺，以及形态学鉴别中依赖人工观察，对于与勃氏牡丹形态上较为相似的龟甲牡丹、龙舌兰牡丹的干扰，使得勃氏牡丹的鉴别成为海关口岸查验工作的亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何突破勃氏牡丹鉴别中对形态学专家的依赖性，提供一种新的鉴别方法，从而缓解人才压力，同时避免人工鉴别中由于人为因素造成的误判。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鉴别勃氏牡丹的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物为5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′ (SEQ ID NO：1)，下游引物为5′-GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ ID NO：2)。

进一步地，在本发明中还进一步公开了一种鉴别勃氏牡丹的试剂，所述的试剂中包括有PCR引物及荧光探针，其中PCR引物包括上游引物和下游引物，上游引物为5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′(SEQ ID NO：1)，下游引物为5′ -GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ ID NO：2)，探针序列为5′TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC-3′(SEQ ID NO：3)。

优选地，所述荧光探针5′端含有FAM荧光报告基团，3′端含有不发荧光的淬灭基团BHQ1。

进一步地，在本发明中还公开了鉴别勃氏牡丹的方法，包括以下步骤：

S1：提取样品植物DNA；

S2：以前述上游引物、下游引物及探针形成的PCR反应体系对S1中提取的样品植物DNA进行扩增反应；

S3：如果有典型的扩增曲线，表明该待测的样品植物为勃氏牡丹；如果没有典型的扩增曲线，说明该待测的样品植物不为勃氏牡丹。

优选地，在本发明中还公开了前述两个扩增反应S2中的退火温度为60℃。

进一步优选地，本发明中还公开了前述两个扩增反应S2中PCR反应参数为 94℃，15s；60℃，1min；40个循环。

同时，在本发明中还公开了鉴别勃氏牡丹的试剂盒，所述试剂盒中包括上游引物5′-CTGGATTTCTCTTGAGCTGTGA-3′(SEQ ID NO：1)，下游引物5′- GGAAGGAAATAGAATGTGGGTT-3′(SEQ ID NO：2)，荧光探针5′-FAM-TGTATCCTATTAGGCTATTACCTGACACC-BHQ1-3′。