[发明专利]一种利用甘露糖合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明涉及一种构建重组大肠杆菌利用甘露糖合成GDP‑岩藻糖，进而生产2′‑岩藻糖基乳糖并提高甘露糖利用率的方法，属于微生物代谢工程领域。所述工程菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除lac操纵子序列中P_lac启动子序列以及lacI、lacZ基因，并且在1acI、lacZ基因位点上过表达wcaG、gmd、lacy基因，之后在基因组上敲除磷酸甘露糖异构酶编码基因manA，过表达磷酸甘露糖变位酶编码基因manB、α‑(1,2)‑岩藻糖基转移酶编码基因futC、甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶编码基因manC所得。本发明提供的2′‑岩藻糖基乳糖从头合成途径生产2′‑岩藻糖基乳糖的发酵策略，能够大幅提高大肠杆菌发酵生产2′‑岩藻糖基乳糖碳源利用率。

技术领域：

本发明涉及一种产2′-岩藻糖基乳糖重组大肠杆菌的构建方法，该菌种具有提高的甘露糖利用效率，属于微生物代谢工程领域。

背景技术：

母乳低聚糖(HMO)是一类独特的、天然存在于母乳中的碳水化合物，对人体健康有诸多益处，目前，人们将重点放在它作为食品添加剂的应用上。

2′-岩藻糖基乳糖(2′-FL)是一种占比最大的母乳低聚糖(HMO)产品(约占31％)，其在肠道中可被有益微生物菌群利用，调节肠道微生物；并且在婴儿奶粉中加入2′-FL可以增强新生婴儿的免疫力，有效的增强新生婴儿体质；2′-FL在大脑发育、神经元传递和突触的形成中也起作用，所以在饮食中添加2′-FL可以促进大脑发育并且能够改善学习和记忆能力。目前，2′-FL主要用于生产婴儿配方奶粉、功能食品和饮料，也可以用做食品添加剂，所以直接合成2′-FL具有良好的前景。

目前，合成2′-FL的方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成需要对2′-FL进行重复且多次的保护和去保护，过程非常繁琐，这会降低产率并且增加成本。利用微生物进行2′-FL 的合成，是目前大范围生产2′-FL可行的方法，而且与化学合成方法相比，生物合成方法更加安全快捷，合成过程中不用引入大量的有毒试剂，这样大大增加了产物的安全性。但是目前利用生物合成的方法合成的2′-FL培养基中的主要使用甘油或者葡萄糖为碳源转化成GDP- 岩藻糖，进而合成2′-FL的转化率普遍不高。目前微生物生产2′-岩藻糖基乳糖主要有两条代谢途径，分别是从头合成途径和补救途径(图1)。从头合成途径主要是从胞内代谢物6-磷酸果糖开始，通过manA(磷酸甘露糖异构酶)、manB(磷酸甘露糖变位酶)，manC(甘露糖-1- 磷酸鸟嘌呤基转移酶)，gmd(GDP-甘露糖-6-脱氢酶)和wcaG(GDP-岩藻糖合成酶)的顺序作用合成GDP-岩藻糖，进一步经过futC(α-(1,2)-岩藻糖基转移酶)的作用，以GDP-岩藻糖和乳糖为底物，合成2′-岩藻糖基乳糖。补救途径是经过岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(Fkp) 的作用，将岩藻糖转化为GDP-岩藻糖，进一步经过futC(α-(1,2)-岩藻糖基转移酶)的作用，以GDP-岩藻糖和乳糖为底物，合成2′-岩藻糖基乳糖。

补救途径需要以岩藻糖为碳源生产2′-岩藻糖基乳糖，由于使用岩藻糖为碳源成本过高，基本不具备工业生产的潜力，而2′-岩藻糖基乳糖的从头合成途径，能够利用甘油或者葡萄糖为碳源合成GDP-岩藻糖进而合成2′-岩藻糖基乳糖，具备工业生产的可能，但由于2′-岩藻糖基乳糖合成途径弱，难以与糖酵解途径竞争，导致大量碳源被细胞生长或代谢消耗，用于生产2′-岩藻糖基乳糖的碳源利用率较低，使2′-岩藻糖基乳糖生产水平较低。

本申请将提供一种利用甘露糖为碳源生成GDP-岩藻糖，进而生产2′-FL的方法。

发明内容：