[发明专利]多酚氧化酶及其编码基因和应用

说明书

本发明提供一种多酚氧化酶及其编码基因和应用。多酚氧化酶可作为合成元件应用在毛蕊花苷、羟基红景天苷或者以这两个化合物为骨架的苯乙醇苷类化合物的体外酶法催化或者体内重构合成，也为深入解析复杂苯乙醇苷类化合物完整的生物合成途径奠定了基础。

技术领域

本发明涉及毛蕊花苷和羟基红景天苷合成技术领域，尤其涉及一种催化合成毛蕊花苷或羟基红景天苷的多酚氧化酶及其编码基因和应用。

背景技术

羟基红景天苷分子式为C₁₄H₂₀O₈，分子量为316.1，CAS号为76873-99-9，研究报道其具有良好的神经保护作用(Ying-Guo Liu et al.，2015)。毛蕊花苷分子式为C₂₉H₃₆O₁₅，分子量为624.6，CAS号为61276-17-3，分布在自然界列当科、唇形科和木犀科等多种植物中，具有抗氧化、抗炎、抗菌、神经保护、调节细胞凋亡等多种生理活性(Lipeng Wuet al.，2020)。

现有毛蕊花苷和羟基红景天苷的化学合成方法工艺流程复杂，亟待开发高效的体外合成方法。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够催化合成毛蕊花苷和羟基红景天苷的多酚氧化酶及其编码基因和应用。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种多酚氧化酶，其序列如a)和b)所示：

a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残且具有催化生成羟基的酶活性的衍生蛋白质。

本发明提供一种上述所述的多酚氧化酶的编码基因，基因序列如下c)或者d)所示：c)如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；d)在严格条件下与c)限定的DNA序列杂交且编码具有催化生成羟基的酶活性的DNA分子。

本发明提供一种包含上述所述的多酚氧化酶的编码基因的表达盒、重组载体或者重组菌。

本发明提供一种重组大肠杆菌，包含催化生成羟基的多酚氧化酶的编码基因。

本发明提供所述的多酚氧化酶在体外催化肉苁蓉新化合物生成毛蕊花苷或者体外催化红景天苷生成羟基红景天苷的工艺中的应用。

本发明提供一种毛蕊花苷和羟基红景天苷的体外合成方法，包括如下步骤：向缓冲液中分别加入底物和多酚氧化酶，所述底物为肉苁蓉新化合物或红景天苷，得混合液；将所述混合液置于25～35℃下反应，在加入冰甲醇淬灭反应。

在其中一些实施例中，所述缓冲液为pH 7～7.5的Tris-HCl缓冲液。

在其中一些实施例中，所述混合液中还含有抗坏血酸、硫酸铜和/或SDS。

在其中一些实施例中，所述混合液中，所述底物和所述多酚氧化酶的浓度比1mM：5μM。

本发明的有益效果是：

与现有技术相比，本发明首次提供一种体外促进生成羟基的多酚氧化酶及其编码基因和应用。该多酚氧化酶可作为合成元件应用在毛蕊花苷、羟基红景天苷或者以这两个化合物为骨架的苯乙醇苷类化合物的体外酶法催化或者体内重构合成，反应更高效。

附图说明

图1为OfPPO2蛋白表达纯化检测胶图。

图2为多酚氧化酶OfPPO2催化红景天苷生成羟基红景天苷的HPLC谱图和LC-MS/MS产物谱图。

图3为多酚氧化酶OfPPO2催化肉苁蓉新化合物生成毛蕊花苷的HPLC谱图。