[发明专利]一种新型TTF-1启动子调控基因及其表达应用

权利要求书

1.一种新型TTF-1启动子调控基因，利用定点突变技术对长度为359bp的TTF-1核心序列进行改造得到，其特征在于：

36986493bp-36986497bp序列由原TGGCT突变为TGGCA，

36986636bp-36986640bp序列由原TGGCC突变为TGGCA，命名为p-^opt1Tcor-miR-7。

2.一种新型TTF-1启动子调控基因，利用定点突变技术对长度为359bp的TTF-1核心序列进行改造得到，其特征在于：

36986493bp-36986497bp序列由原TGGCT突变为TGGCA，

36986563bp-36986567bp序列由原ATGCA突变为TGGCA，

36986610bp-36986614bp序列由原GGGCA突变为TGGCA，

36986636bp-36986640bp序列由原TGGCC突变为TGGCA，命名为p-^opt2Tcor-miR-7。

3.根据权利要求1或2所述的新型TTF-1启动子调控基因的表达方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）、扩增miR-7基因

通过GeneBank获得miR-7前段5’端-1064位点到其3’端侧翼+124位点的序列设计引物；以人肺癌95D细胞基因组DNA为模板，PCR扩增miR-7序列；

2）、p-EGFP-N1-miR-7载体构建

将miR-7的PCR产物克隆入p-EGFP-N1载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后提取质粒，使用限制性内切酶KpnI和BamHI酶做双酶切鉴定，酶切鉴定后测序，通过测序鉴定后得到正确的重组质粒p-EGFP-N1-miR-7；

3）、扩增新型TTF-1启动子

以人肺癌95D细胞基因组DNA为模板，PCR扩增所述新型TTF-1启动子核心序列；

4）、p-^opt1Tcor-miR-7、p-^opt2Tcor-miR-7载体构建

将新型TTF-1核心序列启动子的PCR产物克隆入p-EGFP-N1-miR-7载体中，连接产物经转化、挑克隆、摇菌后提取质粒，使用限制性内切酶AseI和酶KpnI做双酶切鉴定，酶切鉴定后测序，通过测序鉴定后得到正确的重组质粒p-^opt1Tcor-miR-7、p-^opt2Tcor-miR-7；

5）、Real-time PCR探针法检测miR-7表达水平。

4.根据权利要求3所述的新型TTF-1启动子调控基因的表达方法在制备治疗肺癌药物上的应用。