[发明专利]希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法

权利要求书

1.一种希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，其特征在于：采用biobrick的构建策略，利用同尾酶SpeI与XbaI，处理后产生相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将木糖转运蛋白基因gxf1和木糖Weimberg代谢路径相关基因xylB、xylC、xylD、xylX、xylA构建于同一个重组质粒表达载体上，将重组质粒通过转化、接合转移的方式导入到希瓦氏工程菌株S114中获得重组希瓦氏工程菌株S135，其中所述希瓦氏工程菌株S114由希瓦氏工程菌株MR-1在基因组水平敲除转录因子基因NagR得到。

2.根据权利要求1所述希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，其特征在于：利用同尾酶SpeI酶切位点为ctag。

3.根据权利要求1所述希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，其特征在于：XbaI酶切位点为ctag。

4.根据权利要求1所述希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，其特征在于：在T4连接酶的作用下将分别来自中间假丝酵母的核苷酸序列为SEQ ID NO.5的木糖转运蛋白的基因gxf1和来自新月丙杆菌的核苷酸序列为SEQ ID NO.6-10的木糖Weimberg代谢路径相关基因xylB、xylC、xylD、xylX、xylA，经过密码子优化后，按照如下顺序：

gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA逐个连接到核苷酸序列为SEQ ID NO.1的基础质粒PYYDT上,然后通过PYYDT上核苷酸序列为SEQ ID NO.2的tac启动子和核苷酸序列为SEQ IDNO.3的T1终止子表达，得到核苷酸序列为SEQ ID NO.11的重组质粒。

5.根据权利要求1所述希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，其特征在于：重组质粒扩增菌株为Escherichia coli DAP营养缺陷型菌株。

6.根据权利要求1所述希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，其特征在于：采用常规的物理转化法将重组质粒导入扩增菌株E.coli WM3064，然后通过将携带重组质粒的E.coliWM3064与S114进行接合转移，最终将合成后的重组质粒转移到S114中，得到目标工程菌S135。

7.根据权利要求1所述希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，其特征在于：利用摇床摇瓶培养，分光光度计，高效液相色谱仪，典型双室微生物燃料电池，电化学工作站进行实验验证构建菌株利用木糖代谢利用生长情况及微生物燃料电池产电效果。