[发明专利]希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法

说明书

本发明提供一种希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，采用biobrick的构建策略，利用同尾酶SpeI与XbaI，处理后产生相同的粘性末端，在T4连接酶的作用将木糖转运蛋白基因和木糖Weimberg代谢路径相关基因构建于同一个重组质粒表达载体上，将重组质粒通过转化、接合转移的方式导入到两种宿主菌MR‑1和S114中获得重组希瓦氏工程菌株S129和S135的构建方法。有氧生长发酵60h后到达生长平台期，S135和S129生物量分别是WT的21.03倍、12.94倍；培养基中的木糖利用率为S135在48h后消耗木糖约47.69％，S129在96h后消耗木糖约45.03％。

技术领域

本发明属于基因工程和生物代谢技术领域，更具体的说是设计重组质粒以改造希瓦氏菌的代谢通路，使其以木糖底物为唯一碳源进行生长代谢。

背景技术

基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，使外源基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。

希瓦氏菌属是一种兼性厌氧菌，遗传背景清楚，且易于操作。模式产电微生物-奥达奈希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1，简称MR-1，ATCC编号：700550)是希瓦氏菌属中在基因组序列注释和遗传特性方面研究最广泛的菌株。该菌株能够在不添加外源媒介的情况下，将氧化还原反应过程中产生的电子转移到微生物燃料电池(Microbial FuelCell，简称MFC)中的阳极，成为研究微生物如何在MFC中产生电流的模式生物之一。希瓦氏菌一般以乳酸为底物进行生长代谢，不能利用木糖、葡萄糖等储量更为丰富、分布更为广泛的糖类，这限制了希瓦氏菌的底物利用范围和胞外电子传递效率。

木糖(Xylose)(化学式C₅H₁₀O₅)，别称：五碳醛糖。是木聚糖的一个组分，木聚糖广泛存在于植物中，一般可由木屑、稻草、玉米芯等富含半纤维素的植物经水解而得的一种五碳糖，储量丰，也存在于动物肝素、软骨素和糖蛋白中，它是某些糖蛋白中糖链与丝氨酸(或苏氨酸)的连接单位。白色细小结晶或粉末，易溶于热乙醇和嘧啶，可溶于水。木糖与葡萄糖的化学性质相似，可以还原为相应的醇，主要用于制取木糖醇，作为底物发酵生产生物乙醇，在食品加工、制药工业也有广泛应用，可用于染色和制革，由于人体无法消化，不能利用，也被用作无热量甜味剂。能够利用木糖的微生物体内一般包含4种木糖代谢路径：木糖氧化还原酶路径、木糖异构酶路径、Weimberg路径和Dahms路径等，此外，还有两条近期在大肠杆菌中建立的木糖-1-磷酸酯(Xylulose-1-phosphate，X-1-P)及核糖-1-磷酸酯(Ribulose-1-phosphate，R-1-P)途径。

其中，作为原核和真核生物中代谢利用木糖能力比较强的菌株Escherichia coli(简称，E.coli)和Schefersomyces stipites(简称，S.stipites)，分别利用木糖异构酶路径和木糖氧化还原酶路径代谢木糖。在大肠杆菌的木糖异构酶路径中，木糖首先被基因xylA编码的木糖异构酶(xylose isomerase，XI)转化为木酮糖，随后被基因xylB编码的木酮糖激酶(xylulokinase，XK)磷酸化，产生5-磷酸木酮糖进入磷酸戊糖路径进一步代谢。类似于木糖异构酶路径，在S.stipites的木糖氧化还原酶路径中，木糖先被基因XYL1编码的NAD(P)H-依赖的木糖还原酶(xylose reductase，XR)转化为木糖醇，进一步在XYL2编码的木糖醇脱氢酶作用下转化为木酮糖，随后木酮糖在基因XKS1编码的木酮糖激酶的催化下生成5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖路径代谢。木糖氧化还原路径及异构酶路径在生物乙醇的制备具有非常高的应用价值，是发酵工程利用木糖或木糖-葡萄糖混糖制备生物乙醇的重要研究方法之一。