[发明专利]一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶

权利要求书

1.一种基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：通过PCR反应将编码壳聚糖酶的csn基因和信号肽编码DNA序列融合，得到融合后的基因片段；所述csn基因的序列如SEQ ID No.1所示，所述信号肽编码DNA序列如SEQ IDNo.2所示；

步骤2：将融合后的基因片段插入穿梭表达载体中，得到重组表达质粒；

步骤3：将重组表达质粒转化入宿主菌中，即得所述的基因工程菌。

2.如权利要求1所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的穿梭表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达载体，所述大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达载体为pJKK502、pSUGV4、pBE2RS、pGDVM或pHT304。

3.如权利要求1所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的宿主菌为芽孢杆菌属细菌，所述的芽孢杆菌属细菌为Bacillus cereus、Bacillus circulans、Bacillus subtilis或Bacillus thuringiensis。

4.权利要求1～3中任意一项所述的基因工程菌的制备方法制备所得的基因工程菌。

5.权利要求1～3中任意一项所述的基因工程菌的制备方法制备所得的基因工程菌在制备重组壳聚糖酶中的应用。

6.一种基因工程菌BM103，其特征在于，所述的基因工程菌BM103于2021年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC24021，分类命名为枯草芽孢杆菌，拉丁名为Bacillus subtilis。

7.一种重组壳聚糖酶，其特征在于，所述的重组壳聚糖酶中包含由SEQ ID No.1所示的csn基因编码的蛋白质G，所述的蛋白质G由SEQ ID No.2所示的基因片段编码的信号肽分泌表达。

8.如权利要求7所述的重组壳聚糖酶，其特征在于，通过以下步骤制得：

步骤1：将权利要求6所述的基因工程菌BM103接种于LB培养基中培养，得到细菌培养液；

步骤2：将步骤1所得的细菌培养液接种于新鲜的LB培养基中，得到培养液；

步骤3：将步骤2所得的培养液离心分离后收集上清液，依次经过醇沉和亲和层析，即得纯化的重组壳聚糖酶。

9.如权利要求8所述的重组壳聚糖酶，其特征在于，所述步骤1中的培养条件为：在37℃、200rpm条件下振荡培养12-14h。

10.如权利要求8所述的的重组壳聚糖酶，其特征在于，所述步骤2中的培养条件为：在37℃、200rpm条件下振荡培养，直至培养液的OD₆₀₀值达到1.7-1.9。