[发明专利]一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶

说明书

本发明公开了一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶。本发明的基因工程菌的制备方法包括：去除壳聚糖酶编码基因csn信号肽编码序列；将芽孢杆菌信号肽编码序列连接csn，插入大肠杆菌‑芽孢杆菌穿梭载体，并转入芽孢杆菌中，即可获得能够大量分泌表达重组壳聚糖酶蛋白的基因工程菌。将基因工程菌在适宜条件下培养后可大量分泌重组壳聚糖酶，通过简单醇沉及亲和层析即可获得高纯度的重组壳聚糖酶。本发明制备壳聚糖酶的工艺简单，适于工业放大，可广泛应用于食品、药品、生物等领域。

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶，属于生物工程技术领域。

背景技术

甲壳素是地球上仅次于纤维素的第二大天然类高分子化合物，经脱乙酰后成为壳聚糖。壳聚糖含有游离氨基，是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有可生物降解、细胞亲和性和多种生物活性。但是，由于壳聚糖水溶性差，难以发挥大多数生物活性，大大限制壳聚糖的应用。近年发现壳聚糖的水解产物壳寡糖具有独特的生理活性。壳寡糖由2-20个单糖通过糖苷键连接，相较于壳聚糖具有水溶性好、易于吸收、功能性强、生物活性高等特点，被科学界誉为“第六大生命元素”，在食品、药品、生物等领域应用广泛。因此，关于壳寡糖的生产受到广大研究人员的高度重视，也取得显著成效。

目前，壳寡糖常见的制备方法有物理降解法和化学降解法。物理降解法以微波、超声波、辐照、射线、加热、加压等方式断裂壳聚糖分子中的糖苷键。物理法污染小，产物纯度高且结构简单，但设备成本高、生产效率低，因此通常与其他方法结合，工业上未建立纯物理法大规模生产壳寡糖。目前工业化生产壳寡糖的传统方法是化学降解法，即酸法水解制备壳寡糖。利用壳聚糖分子中的氨基基团与酸性溶液中的氢离子结合，使壳聚糖分子间氢键断裂，形成聚合度不同的混合产物。该方法技术要求相对较低，降解速度快，设备、原料成本较低，非常适合工业化生产。但化学法反应复杂，难以控制，降解副产物多，污染大，且水解反应会破坏壳聚糖分子中的糖苷键，过度水解时糖苷键全部断裂生成单糖，因此分离纯化成本高，壳寡糖收率低。

随着生物技术的发展，酶法逐渐被应用于壳寡糖的制备。壳聚糖酶(Chitosanase)通常由细菌、放线菌、真菌等微生物发酵生产，其中细菌来源最丰富，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属等。壳聚糖酶属水解酶，可分为内切酶和外切酶。其中壳聚糖内切酶以内切方式专一性水解壳聚糖分子中的β-1,4糖苷键。壳聚糖酶水解制备壳寡糖工艺对环境友好，可以低成本控制产品的聚合度。与前两种方法相比，酶法制备壳寡糖可克服物理法得率低与化学法选择性差的缺点，且因其高效可控、条件温和、选择性高等优点近年逐渐引发关注。

壳聚糖酶可通过菌株分泌获得，由于大多数野生菌株产壳聚糖酶效率低，成本高，造成壳寡糖生产成本相应提高，限制了酶解法制备壳寡糖的工业化应用。菌种筛选、高密度发酵、优化培养条件等方法，虽然在一定程度上提高了野生菌株壳聚糖酶产量，但仍难以满足工业化需求。随着科技进步，构建重组壳聚糖酶并用于壳寡糖制备成为发展趋势。然而胞内表达壳聚糖酶的纯化需经过细胞破碎等繁琐步骤，不仅提高了酶的制备成本，酶活也会受到影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：目前胞内表达壳聚糖酶的纯化需经过细胞破碎等繁琐步骤，从而导致壳聚糖酶的制备成本高和酶活下降等问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：通过PCR反应将编码壳聚糖酶的csn基因和信号肽编码DNA序列融合，得到融合后的基因片段；所述csn基因的序列如SEQ ID No.1所示，所述信号肽编码DNA序列如SEQ ID No.2所示；

步骤2：将融合后的基因片段插入穿梭表达载体中，得到重组表达质粒；

步骤3：将重组表达质粒转化入宿主菌中，即得所述的基因工程菌。