[发明专利]一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品、RNA标准品及其应用

说明书

本发明涉及基因重排标准品技术领域，本发明提供了一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品、RNA标准品及其应用。本发明是将针对EGFR‑E1基因的1号内含子的sgRNA构建到载体pX330上，得到质粒E1‑2，将针对EGFR‑E7基因的7号内含子的sgRNA构建到载体pX330上，得到质粒E7‑3，将质粒E1‑2和质粒E7‑3共同转染宿主细胞，得重组细胞，再对重组细胞进行单克隆化，得到制备DNA标准品或RNA标准品的细胞，进而得到DNA和RNA标准品。本发明提供的EGFR vIII重排标准品序列和细胞，样品可以稳定长期提供，非常适用于LDT或IVD开发的性能评价和长期的质控需求。

技术领域

本发明涉及基因重排标准品技术领域，尤其涉及一种用于分子诊断的EGFR vIII重排的DNA标准品、RNA标准品及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR/ErbB1/HER1)是酪氨酸激酶受体家族的成员，还包括ErbB2/HER2/Neu、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。所有这些受体都是跨膜糖蛋白，分子量范围从170kDa到185kDa。通常，它的激活涉及配体结合和随后的受体二聚化。EGF受体的激活可在Ras/Raf/MAPK、PI3K/AKT、JAK/STAT或PLC/PKC通路中诱导信号，对多种细胞过程产生影响，包括增殖、代谢、凋亡、细胞存活或分化。信号级联的终止发生在受体内化后，主要是网格蛋白依赖性内吞作用，导致其进入早期内体。此外，受体可能被转运回细胞膜或在晚期内体和溶酶体中降解。

编码EGFR的基因位于7号染色体(p11.2)的短臂上，由28个外显子组成。成熟的EGFR蛋白(1186个氨基酸)由前体蛋白(1210个氨基酸)在去除N末端部分后形成。从N到C末端，EGFR由参与配体结合和受体二聚化的胞外域(外显子1-16)、疏水跨膜域(外显子17)和具有酪氨酸激酶活性的胞内域组成，其两侧是接头区域和受体的C端部分(外显子18-28)。细胞内结构域的20个酪氨酸残基中有12个被证明经历了磷酸化，这些结合受体激活后募集的膜结合或细胞质效应蛋白。

胶质母细胞瘤(GBM)是成人中最常见的恶性脑肿瘤，也是所有癌症中最致命的，目前的治疗方法：手术、放疗和化疗，中位生存期仅为12-15个月。

在GBM中，EGFR扩增在大多数情况下伴有基因重排。此类改变涉及特定外显子或外显子部分的缺失，并被指定为EGFR vI(N末端部分缺失)、EGFR vII(外显子14和15缺失)、EGFR vIII(外显子2-7缺失)、EGFR vIV(外显子25-27缺失)和EGFR vV(外显子25–28缺失)。

在胶质母细胞瘤(GBM)中，最常检测到的变异之一是EGFR vIII。大约50％的GBM患者中EGFR发生了扩增，大约50-60％的扩增中同时伴随有EGFR vIII重排。EGFR vIII的出现是由于EGFR外显子2-7的缺失，产生了一个能够组成型EGFR激活的截短的细胞外结构域。截短的细胞外结构域产生了一个新的肽序列，从而产生了独特的、GBM细胞特异性、抗体反应性EGFR vIII抗原。其中，EGFR WT和EGFR vIII的结构示意图如图1所示。

在GBM的诊断中，NCCN指南提到了EGFR amplification和EGFR mutation，EGFRvIII的突变可以既称为EGFR mutation，又经常会导致EGFR的扩增，因此是一个重要的诊断指标。其中，NCCN-2021第二版中枢神经系统肿瘤分子标志物截图如图2所示。

近些年来，国内出现很多公司去开发检测EGFR vIII的试剂盒，在试剂盒的开发中，需要有标准品对整个检测体系做性能评价，按照第三类医疗器械肿瘤检测试剂盒开发的指导原则上描述，用于实验性能评价需要对应的标准品，标准品不能是质粒，最好是临床样本。但是在实际检测过程中，临床样本往往是可遇不可求的，需要正好碰到这样的病人，而且样本不可再生，量较少，不适合作为IVD试剂盒开发长期使用的标准品、质控品。