[发明专利]一种快速筛选八角莲中多靶标活性配体的方法

说明书

本发明公开了一种快速筛选八角莲中多靶标活性配体的方法，八角莲总提物与DNA拓扑异构酶I、拓扑异构酶II、环氧合酶‑2和血管紧张素转化酶2进行孵育，八角莲中具有亲和活性的小分子配体与这四种生物靶分子形成受体‑配体复合物，孵育结合后的混合液通过一定截留孔径的超滤管将复合物截留在超滤膜的一侧，然后经处理将小分子配体释放出来，再利用仪器分析筛选出活性配体；实现了对复杂天然产物中生物活性成分或先导化合物的高通量筛选和快速鉴定，及对多靶点、多组分的作用机理的研究，为新药开发领域提供新思路和新方法。

技术领域

本发明涉及天然产物活性化合物分析技术领域，具体涉及快速筛选八角莲中多靶标活性配体的方法。

背景技术

八角莲为小檗科鬼臼属多年生草本植物，是一种具有极高药用价值的中草药，可用于治疗跌打损伤、风湿疼痛、毒蛇咬伤和月经不调等症。迄今为止，从八角莲中分离、鉴定得到的化学成分主要是木脂素类和黄酮类化合物。

相关技术中，多靶标活性配体的筛选方法一般使用光谱法或核磁共振法。但发明人发现，这些方法在一定程度上满足筛选需求，但同时存在着局限性，如光谱法易受到背景干扰而产生假阳性或假阴性现象，而核磁共振法不适宜定量研究结合参数；且这些方法只能逐一筛选各种靶标酶，筛选过程繁琐，工作量大。

发明内容

有鉴于此，本发明的实施例提供了一种高灵敏度、不易受到背景信号干扰、可定量同时筛选多靶标酶的快速筛选八角莲中多靶标活性配体的方法。

本发明的实施例提供了一种快速筛选八角莲中多靶标活性配体的方法，包括以下步骤：(1)配制酶促反应缓冲溶液；

(2)配制待测样品溶液；取适量八角莲总提物溶解于所述酶促反应缓冲液中得到待测样品溶液；

(3)待测样品溶液与多靶酶亲和反应；分别取适量的待测样品溶液、DNA拓扑异构酶I、拓扑异构酶II、环氧合酶-2、血管紧张素转化酶2于离心管中，混合均匀后恒温孵育反应，反应结束后于超滤离心管中用酶促缓冲溶液多次洗脱，对洗脱截留配体采用有机溶剂洗脱，收集洗脱液得到实验组溶液；采用失活酶作为对照组，其余与实验组相同得到对照组溶液；

(4)采集出峰数据；取适量上述待测样品溶液、实验组溶液、对照组溶液冷冻干燥，后加入有机溶液溶解后仪器分析，采集出峰数据；

(5)计算富集率筛选出八角莲中的活性配体；通过上述出峰数据计算富集率，得到DNA拓扑异构酶I、拓扑异构酶II、环氧合酶-2、血管紧张素转化酶2对八角莲筛选后的活性配体，富集率公式为

EF(％)＝(A₁-A₂)/A₀×100％

其中，EF为多靶酶与八角莲筛选的多靶标活性配体间的富集因子，A₀、A₁和A₂分别代表不加酶和经与活性酶以及失活酶处理的八角莲的各色谱峰峰面积。

优选地，所述步骤(1)中，所述酶促反应缓冲液为0.1mol/L的磷酸钠溶液或0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；取50mL的0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液与34.5mL的0.1mol/L盐酸混匀后，使用去离子水稀释至100mL，得到pH值为7.8的0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐酶促缓冲；分别取1mol/L磷酸氢二钠溶液和1mol/L磷酸二氢钠溶液46.3mL和53.7mL，使用去离子水溶解至总体积为1L，充分混合后得到pH值为6.8的0.1mol/L的磷酸钠酶促缓冲溶液。

优选地，所述步骤(2)中，取适量八角莲总提物于酶促反应缓冲液充分溶解，得到浓度为8.0mg/mL八角莲待测样品溶液。