[发明专利]抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用

权利要求书

1.一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列，其特征在于，所述干扰序列为shCB1-1或shCB1-2或shCB1-3；

其中，shCB1-1靶位点序列为5’-CCACAGAAATTCCCTCTAA-3’；

shCB1-2靶位点序列为5’-CCATGTATTCCACCGTAAA-3’；

shCB1-3靶位点序列为5’-GCTTATCAAGACGGTGTTT-3’。

2.一种含有权利要求1所述的抑制Cnr1基因表达的干扰序列的shRNA慢病毒载体。

3.一种如权利要求2所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、合成干扰序列shCB1-1或shCB1-2或shCB1-3；

S2、配制50ul酶切反应体系：质粒2ug、10×反应Buffer 5ul、限制性内切酶各1ul、去离子水补足50ul，于37℃水浴锅中孵育2h以上，得线性化表达载体；其中，表达载体的浓度为40ng/ul；

S3、配制20ul反应体系：1ul目的基因片段、3ul线性化载体、2ul 10×T4 DNA ligaseBuffer、1ul T4 DNA ligase、dd H₂O补齐20ul，该反应体系在16℃中过夜；

S4、将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定；

S5、将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行测序验证，软件比对测序结果并分析；

S6、测序通过的阳性克隆，安排质粒抽提。

4.如权利要求3所述的一种shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中将连接产物转化到DH5α感受态细胞的具体步骤为：

(1)将1ul浓度大于10ng/ul的连接产物缓慢加入到感受态细胞中，冰浴30min；

(2)42℃水浴锅热激90s，冰浴2min；

(3)加入500ul无抗生素的培养基，于37℃、220rpm恒温振荡器培养60min；

(4)取80ul转化液，使用涂布棒均匀涂在固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。

5.如权利要求3所述的一种shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中的PCR反应条件为：94℃、30s；55℃或60℃、30s；72℃、1min；98℃、10s；68℃、1min。

6.一种如权利要求1所述的干扰序列在制备抑制Cnr1基因表达的生物制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述干扰序列在制备防治慢性内脏痛和抑郁症的生物制剂中的应用。