[发明专利]抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用

说明书

本发明公开一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用，本发明针对Cnr1基因编码的1型大麻素受体CB1R设计了shRNA序列，并构建了相应的shRNA慢病毒载体。通过实验结果证实本发明的shRNA慢病毒能够显著抑制CB1 mRNA和蛋白的表达，同时能够缓解慢性内脏痛和抑郁样行为。鉴于CB1R参与应激反应和抑郁的调节，因此本发明提供的CB1R的shRNA及其相关生物制剂，可用于研究及制备治疗慢性内脏痛和抑郁症的相关疾病的药物。

技术领域

本发明涉及一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用，属于分子生物学与生物医药技术领域。

背景技术

慢性内脏痛(chronic visceral pain)是一组以不明原因的腹痛或腹部不适，伴有排便习惯和大便性状改变为主要特征的肠道功能性疾病。其典型代表疾病是肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)，最新流行病学显示IBS影响了全球约10％的人口。严重影响病人的健康和生活质量，并伴随着巨大的医疗费用。在IBS患者中，内脏超敏反应是其重要的病理生理特征，表现为机械性刺激引起的结直肠组织疼痛阈值降低，出现痛觉过敏。但由于对其发病机制的认识不足，尚不能对肠易激综合征进行针对性的治疗。因此，探索出新的慢性内脏痛治疗靶点对疾病的治疗，提高病人的生活质量具有非常重要的意义。

目前慢性内脏痛在临床上的治疗方法通常采用体表疼痛的治疗框架和方案，然而，由于内脏的神经支配及其疼痛发病机制与体表疼痛的差异，进行有针对性的治疗就显得十分重要。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性降低或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。miR30shRNA干扰载体系统是用于多种哺乳动物细胞中，高效干扰靶基因表达的方法。与常规shRNA载体不同，基于miRNA的shRNA干扰载体系统采用了标准RNA聚合酶II启动子，这使得可以运用组织特异性，诱导型或可变强度的启动子进行实验。RNA聚合酶II启动子会驱动包含目的基因和一个或多个基于miR30的靶向目的基因的shRNA(shRNAmiR)多顺反子的表达。shRNAmiR转录物通过胞内micro-RNA途径加工产生成熟的shRNA，促进靶基因mRNA的降解。已有研究证明，shRNAmiR干扰技术参与疼痛的调节。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用，可用于研究慢性内脏痛相关疾病的治疗，极具应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用的一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列，所述干扰序列为shCB1-1或shCB1-2或shCB1-3；

其中，shCB1-1靶位点序列为5’-CCACAGAAATTCCCTCTAA-3’；

shCB1-2靶位点序列为5’-CCATGTATTCCACCGTAAA-3’；

shCB1-3靶位点序列为5’-GCTTATCAAGACGGTGTTT-3’。

本发明的另一目的还提供了一种含有所述抑制Cnr1基因表达的干扰序列的shRNA慢病毒载体。

本发明的又一目的是提供一种所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

S1、合成干扰序列shCB1-1或shCB1-2或shCB1-3；

S2、配制50ul酶切反应体系：质粒2ug、10×反应Buffer 5ul、限制性内切酶各1ul、去离子水补足50ul，于37℃水浴锅中孵育2h以上，得线性化表达载体；其中，表达载体的浓度为40ng/ul；