[发明专利]一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒及其应用

权利要求书

1.一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒，其特征在于，包括用于敲除A.keratiniphila HCCB10007大的片段基因的双sgRNA和敲除A.keratiniphilaHCCB10007上的大片段基因后用于同源重组修复的上下游同源臂，所述双sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述用于同源重组修复的上下游同源臂是以A.keratiniphila HCCB10007基因组为模板，分别用SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10所示的引物进行PCR扩增获得。

2.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9编辑质粒，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9编辑质粒是通过如下步骤构建获得：

步骤一、使用Hind III酶切pLYNY04质粒，获得酶切后的载体；将酶切后的线性化载体与所述的上下游同源臂采用overlap重组的方式进行连接以获得骨架质粒；

步骤二、使用SpeⅠ酶切骨架质粒，获得线性化骨架载体；将如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的两条oligo退火连接形成双链sgRNA-1，将如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两条oligo退火连接形成双链sgRNA-2，然后将线性化骨架载体分别与双链sgRNA-1和双链sgRNA-2采用overlap重组的方式进行连接，获得含有单一sgRNA-1的编辑质粒和含有单一sgRNA-2的编辑质粒；

步骤三、使用XbaI酶切含有单一sgRNA-1的编辑质粒，获得线性化sgRNA-1载体；以含有单一sgRNA-2的编辑质粒为模板，用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物利用PCR的方法扩增含有ermE^*启动子和sgRNA-2的基因片段；然后将ermE^*启动子和sgRNA-2的基因片段与含有单一sgRNA-1的编辑质粒的线性化sgRNA-1载体进行连接，获得含有双sgRNA的编辑质粒pHMYECO4-26。

3.一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、以A.keratiniphila HCCB10007基因组为模板，分别用SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的引物进行PCR扩增，获得用于同源重组修复的上下游同源臂；

步骤二、使用Hind III酶切pLYNY04质粒，获得酶切后的载体；然后将酶切后的线性化载体与扩增得到的上下游同源臂采用overlap重组的方式进行连接以获得骨架质粒；

步骤三、使用SpeⅠ酶切骨架质粒，获得线性化骨架载体；将如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的两条oligo退火连接形成双链sgRNA-1，将如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两条oligo退火连接形成双链sgRNA-2，然后将线性化骨架载体分别与双链sgRNA-1和双链sgRNA-2采用overlap重组的方式进行连接，获得含有单一sgRNA-1的编辑质粒和含有单一sgRNA-2的编辑质粒；

步骤四、使用XbaI酶切含有单一sgRNA-1的编辑质粒，获得线性化sgRNA-1载体；以含有单一sgRNA-2的编辑质粒为模板，用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物利用PCR的方法扩增含有ermE^*启动子和sgRNA-2的基因片段；然后将ermE^*启动子和sgRNA-2的基因片段与含有单一sgRNA-1的编辑质粒的线性化sgRNA-1载体进行连接，采用overlap重组的方式，获得含有双sgRNA的编辑质粒pHMYECO4-26。

4.一种如权利要求1或2所述的含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒在水解角蛋白拟无枝酸菌中进行大片段基因敲除的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水解角蛋白拟无枝酸菌包括A.keratiniphila HCCB10007。