[发明专利]一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒及其应用

说明书

本发明公开了一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒，包括双sgRNA和上下游同源臂，所述双sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述的上下游同源臂是以A.keratiniphila HCCB10007基因组为模板，分别用SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的引物进行PCR扩增获得。本发明还公开了所述的CRISPR/Cas9编辑质粒在水解角蛋白拟无枝酸菌中进行大片段基因敲除的应用。本发明实现了在水解角蛋白拟无枝酸菌中进行80kb以上大片段基因的精准敲除。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒及其应用。

背景技术

微生物次级代谢产物是临床上广泛应用的各类抗生素、抗病毒药物、抗真菌药物、免疫抑制剂等药物的重要来源。由于微生物基因组的复杂性，除了生长繁殖相关的必须基因外，基因组中还存在着众多次级代谢生物合成基因簇。但有很多次级代谢生物合成基因簇处于沉默状态，甚至属于冗余基因，其存在会与目标产物的生物合成产生竞争，它的表达会消耗大量初级代谢产生的能量和前体，并且还会导致杂质的产生，降低目标产物的产量并且为分离与纯化增加难度。因此对微生物细胞进行工程设计，去除冗余的大片段基因，以高效合成高附加值的天然产物已受到越来越多的关注。

传统基因组简化的方法包括同源重组、双链断裂修复重组、位点特异性重组、转座重组，但它们都或多或少存在基因编辑工具构建复杂、在基因组上残留片段无法实现无痕敲除、基因删减存在不确定性等问题。CRISPR/Cas9系统，是目前应用较为广泛的高效、简便、能对基因组进行定点编辑的新技术，该系统只需Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA连接而成的sgRNA参与。CRISPR/Cas9系统能够对基因进行高效编辑，利用同源重组修复的方式能实现基因无痕敲除。

万古霉素是目前临床上治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的首选药物，还应用于治疗对所有抗生素均无效的严重感染，在临床治疗中具有重要意义。A.keratiniphila HCCB10007是经过物理、化学方法诱变选育而来的万古霉素高产菌株，基因组包含一个环状染色体、一个环形内源性质粒。染色体基因组全长8,948,591bp，GC含量69％，通过对其进行生物信息分析，预测到在基因组中存在至少26个次级代谢生物合成基因簇。虽然CRISPR/Cas9系统已成功地应用于大肠杆菌、酿酒酵母菌、肺炎链球菌、链霉菌等微生物，在链霉菌中进行大片段基因编辑也有较高效率，A.keratiniphila HCCB10007虽然同属于放线菌，但与链霉菌相比，其基因组结构更加复杂，次级代谢产物网络更加庞大，在该菌株上应用CRISPR/Cas9技术进行大片段基因敲除仍然具有极大挑战性。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒。本发明的第二个目的在于提供一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒的构建方法。本发明的第三个目的是提供一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒在水解角蛋白拟无枝酸菌中进行大片段基因敲除的应用。本发明的第四个方面是提供一种用于敲除A.keratiniphila HCCB10007大的片段基因的双sgRNA。本发明的第五个方面是提供一种敲除A.keratiniphila HCCB10007上的大片段基因后用于同源重组修复的上下游同源臂。本发明的第六个方面是提供一种敲除大片段基因的A.keratiniphila HCCB10007突变菌株。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：