[发明专利]Tecrl敲除小鼠模型的构建方法及其应用

说明书

本发明提供一种Tecrl敲除小鼠模型的构建方法及其应用，所述Tecrl敲除小鼠模型的构建方法为：A、根据基因敲除的靶点，设计针对Tecrl基因的sgRNA；B、将Cas9mRNA及sgRNA同时注射入实验小鼠的受精卵中，得到Tecrl基因成功敲除的F0代小鼠。本发明首次构建了一种Tecrl敲除小鼠模型，并发现该先天的小鼠基因缺陷导致小鼠在早期的时候就会出现心脏收缩和舒张功能的受损，为研究左心功能提供了模型。且该Tecrl敲除小鼠在肾上腺素和咖啡因的诱导下出现了多形性及双向性室速，模拟了临床上CPVT患者在运动或压力状态下出现的临床表现，为儿茶酚胺敏感性室速的病理生理机制研究提供有力的工具。

技术领域

本发明涉及一种小鼠模型构建技术领域，尤其是涉及一种Tecrl敲除小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术

由心律失常引起的心源性猝死是无心脏器质性改变的患者死亡的主要原因。儿茶酚胺敏感性室速(CPVT)是一种遗传性的离子通道病，主要发生于7-12岁的儿童，发病率约为1/10000。其主要的临床特征为运动或情绪激动所诱发的多形性或双向性室速。部分儿茶酚胺敏感性室速患者的首发症状即为晕厥或猝死。但目前具体的发病机制仍未明确。

儿茶酚胺敏感性室速的诊断主要依靠具有特征性的心电图及基因检测确诊。对于典型CPVT患者，心电图运动负荷试验或注射儿茶酚胺类药物可以有效诱发出多形性或双向性室速。并且在未经任何治疗的情况下，发生心律失常的阈值及心律失常的形态可重复出现。

目前CPVT主要分为三型，分别为CPVT1型、CPVT2型及CPVT3型。CPVT1型是由RyR2基因突变所引起常染色体显性遗传病，约占CPVT患者总数的50-60％。CPVT2型是由CaSQ2基因突变引起的常染色体隐性遗传病，约占CPVT患者总数的5％。CPVT3型由TECRL基因缺陷引起，由法国的Devalla教授在2016年首次发并报道。然而目前缺乏对于TECRL基因缺陷患者在未出现心脏器质性改变前就发生CPVT的发病机制清晰的阐述。

TECRL主要位于内质网，与TECR基因高度同源。TECRL基因的缺陷会伴随有RyR2和CASQ2的减少。而在hiPSC-CM细胞上的研究发现TECRL基因缺陷还会导致细胞内外钙离子失衡，从而导致DADs发生的增加。

近年来，越来越多研究CPVT发病机制的小鼠模型得以构建，但主要包括RyR2基因突变的小鼠模型，如RyR2(R4496C,N2386I,A165D)等表现出CPVT的典型临床表现。CASQ2位点突变的小鼠模型CASQ2(Casq2D307H,Casq2DeltaE9/DeltaE9)可体外模拟CPVT。具有这些突变的小鼠均表现出了运动或压力诱发的心律失常，体内钙环境的紊乱及线粒体超微结构的受损。但目前为止，仍没有Tecrl突变的CPVT小鼠模型。因此构建Tecrl基因敲除的小鼠模型对于研究Tecrl基因缺陷对心脏功能改变的影响有着至关重要的作用。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种Tecrl敲除小鼠模型的构建方法及其应用。

第一方面，本发明提供了一种Tecrl基因缺陷小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

A、根据基因敲除的靶点，设计针对Tecrl基因的sgRNA，所述sgRNA的序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；

B、将Cas9 mRNA及sgRNA同时注射入体外培养的实验小鼠受精卵中，再将受精卵移植到超排的母鼠内，得到Tecrl基因成功敲除的F0代小鼠。

优选地，所述方法还包括将Tecrl基因成功敲除的F0代小鼠进行回交得到稳定基因型的F1代小鼠，将F1代小鼠与野生型小鼠杂交得到F2代小鼠，再将F2代小鼠相互交配得到F3代Tecrl敲除小鼠的步骤。

优选地，步骤B中，所述Cas9 mRNA和sgRNA注射量分别为20ng/μL,5ng/μL。