[发明专利]一株抗病促生草莓生物菌及生物有机肥制备方法

权利要求书

1.一种抗病促生草莓生物菌，其特征在于所述的抗病促生草莓生物菌为解淀粉孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已于2020年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.19859。

2.根据权利要求1所述的一种抗病促生草莓生物菌的应用，其特征在于所述的抗病促生草莓生物菌应用于肥料中，所述的肥料为微生物肥料。

3.根据权利要求1所述的一种抗病促生草莓生物菌分离筛选方法，其特征在于所述的分离筛选方法至少包括如下步骤：

(1)土壤样品的采集与根际功能微生物的分离

采集温州苍南县马站镇设施种植大棚发病区块内健壮的植株，轻轻带土拔出植株，带回实验室用于抗病促生菌株的分离筛选，采集时间为2019年。分离筛选时，轻轻抖落植株根系上松散的附着土，将植株自根茎处剪断，称取10g带根际土的植物根系，置于盛有灭菌玻璃珠和90mL无菌水的锥形瓶中，28℃、170r·min^-1振荡30min，得到悬浮液，按照梯度浓度稀释，涂布于LB培养基上，选择10^－4、10^－5、10^－6三个梯度进行涂布，每个梯度三次重复，恒温培养箱中在28℃下，倒置培养18h，挑取生长迅速、不同形态的单菌落于新的平板上，划线纯化3-4次，分别编号，挑取菌落加入体积分数为15％的灭菌甘油于-80℃保藏待用；

(2)拮抗功能微生物的筛选

采用平板对峙法，以尖孢镰刀菌作为目标病原菌株，将病原菌接种到PDA平板中，同时在平板四周接种分离到的根际微生物，通过比较抑菌圈的大小，筛选具有高效抗病的功能微生物菌株；

(3)功能微生物的鉴定

利用16S rDNA测序技术对获得功能微生物进行鉴定，PCR扩增16S rDNA片段的引物为一对通用引物，正向引物BSF8/20：5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'；反向引物BSR1541/20：5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'；PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5.0μl，MgCl2 25mM3.0μl，dNTP 4.0μl，引物BSF8/20和引物BSR1541/20各1.0μl，模板DNA 1.0μl，Taq酶10000U/mL 0.25μl，重蒸水36.0μl。PCR程序如下：(1)94℃5min；(2)94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，第2步循环35次；(3)72℃10min；(4)4℃10min；PCR扩增16S rDNA序列经测序后，在NCBI网站上进行比对，获得菌株的分类信息；

(4)拮抗功能微生物的分离

为了筛选获得具有高效拮抗作用的功能微生物，将前期从健康植株根部分离到的根际微生物接种到斜面培养基上进行培养，累计获得具有不同形态的微生物13株，培养后将其接种到中间接种有尖孢镰刀菌的PDA培养基平板上，进行对峙试验，在培养箱培养后，观察抑菌圈的大小，选择抑菌圈较大的菌株用于进一步验证和纯化，得到的结果是：分离的菌株中KS12具有显著的抑制圈，表明其抑菌活性较强，用于进一步的进行鉴定和功能验证，同时根据实验室菌株保藏要求，将该分离的菌株KS12，命名为WSW1；

(5)菌株WSW1的鉴定

菌株的鉴定采用通用引物扩增菌株WSW1的16S rDNA序列，序列在RDP网站上进行了序列比对，经比对后与Bacillus amyloliquefaciens的相似性最高，将其命名为Bacillusamyloliquefaciens WSW1。

4.根据权利要求1所述的一种抗病促生草莓生物菌剂的制备方法，其特征在于所述的制备方法如下：

(1)菌株WSW1生物菌剂的制备

拮抗菌菌剂制备：将低温冰箱保藏的菌株WSW1接种到LB斜面上进行活化，将活化后的斜面菌种，接种到LB液体培养基中，在30℃的摇床中，以150rpm的转速下振荡培养3天，形成具有大量芽孢的菌剂，即获得拮抗菌菌剂。

(2)、抗病促生混合菌剂的制备

为提高抗病促生作用，将所述拮抗功能微生物菌株WSW1制备的菌剂与阿氏芽孢杆菌制备的菌剂按照1:1的体积比混合即得到抗病促生混合菌剂。

(3)、生物有机肥的制备

将制备好的WSW1菌剂，按照1％的比例添加到经过充分腐熟的猪粪有机肥中，经过充分搅拌后，制备而成生物有机肥，其中用于生物有机肥制备的猪粪有机肥由猪粪和木屑或者秸秆按照4:1的比例经过高温发酵制备而成，高温发酵即堆肥温度55℃的时间应不小于30天，发酵结束后接种之前应该进行堆肥pH的测定，pH应在5.5-7.5之间。