[发明专利]基于琼脂糖堆叠凝胶的蛋白电泳分离方法

权利要求书

1.一种基于琼脂糖堆叠凝胶的蛋白电泳分离方法，其特征在于，其步骤如下：

1)、凝胶灌制前准备

用Tris-Cl、NaCl配置凝胶缓冲液，浓度分别为0.25M Tris-Cl、0.04～0.2％NaCl，备用；

用Tris-Cl、SDS配置电泳缓冲液，浓度分别为0.25M Tris-Cl、0.2～1.0％SDS，备用；

顶层胶盒的制作：取长方形盒子，其长度略小于玻璃板灌胶器的内孔长度，在盒子底部平行于长边方向开设一个细缝，细缝宽度略大于玻璃板灌胶器的内孔宽度，在盒子底部的外侧于细缝两侧对称设置两条硅胶条，硅胶条之间的距离等于玻璃板灌胶器的厚度；

2)、琼脂糖堆叠凝胶灌制：

S1、琼脂糖堆叠凝胶下层凝胶灌制：按浓度为8～14％的琼脂糖溶液的配制标准，将凝胶缓冲液、琼脂糖混合后，在蒸汽环境中于高温、高压的条件下溶解得到澄清的8～14％琼脂糖溶胶，备用；玻璃板灌胶器和顶层胶盒于75～85℃进行预热，然后在75～85℃的环境中将玻璃板灌胶器竖向放置，把顶层胶盒安装在玻璃板灌胶器顶部，顶层胶盒底部的细缝对准玻璃板灌胶器的内孔，将温度为75～85℃的琼脂糖溶胶倒入顶层胶盒中，待溶胶流满玻璃板灌胶器的内孔后室温放置20～40min，等待溶胶凝固；

S2、琼脂糖堆叠凝胶上层凝胶灌制：

溶胶凝固后，用梳子由下朝上把凝胶从玻璃板灌胶器中推出2.5～3.0cm，然后对齐玻璃板灌胶器边沿切除推出的琼脂糖凝胶；将玻璃板灌胶器倒转180度，取出梳子，重新于75～85℃进行预热3～5分钟；按浓度为3～4％的琼脂糖溶液的配制标准，将凝胶缓冲液、琼脂糖混合后加热溶解得到3～4％琼脂糖溶胶，将3～4％琼脂糖溶胶从上部注入玻璃板灌胶器的内孔中，插入梳子到1.5～2cm，室温放置20～40min，等待溶胶完全凝固；

3)、琼脂糖堆叠凝胶电泳分离蛋白：

在电泳仪中将目标蛋白样本上样后，按9～11V/cm凝胶长度的标准用电泳缓冲液进行恒电压电泳4～5小时至溴酚蓝前沿到达凝胶底部，凝胶放入考马斯亮蓝R-250染色液中染色过夜，然后转移到脱色液中脱色4～5小时，用凝胶扫描仪扫描获得了电泳图谱，获得不同的蛋白条带。

2.根据权利要求1所述的基于琼脂糖堆叠凝胶的蛋白电泳分离方法，其特征在于：所述的高温、高压是指温度为115～121℃，压力为1.6×10⁵Pa～2.1×10⁵Pa。