[发明专利]基于琼脂糖堆叠凝胶的蛋白电泳分离方法

说明书

本发明属生物技术领域，涉及一种基于琼脂糖堆叠凝胶的蛋白电泳分离方法，先配置凝胶缓冲液、电泳缓冲液，制作顶层胶盒，然后高浓度琼脂糖堆叠凝胶下层凝胶灌制、琼脂糖堆叠凝胶上层凝胶灌制，最后利用琼脂糖堆叠凝胶进行电泳分离蛋白。本发明工艺简单，操作简便，以琼脂糖配合相应的凝胶缓冲液，采用层叠的方式将高浓度的琼脂糖凝胶进行垂直堆叠，利用设定的电泳条件，能够在较高浓度条件下利用琼脂糖凝胶对蛋白进行电泳分离，提高了琼脂糖凝胶电泳在蛋白质分离中的适用范围。

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种蛋白分离方法，具体是一种采用高浓度琼脂糖堆叠凝胶对蛋白进行电泳分离的方法。

背景技术

蛋白质作为生命活动的重要物质存在于一切生物体中，在生物体的生活周期中扮演了至关重要的角色，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控、记忆、识别等多种生理功能，因此，针对蛋白质的研究技术是生命科学领域中的一个关键点。由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质的分离与纯化是生物产业中的核心技术，通过分离蛋白，得到纯化的蛋白质样品，才能对其进行结构大小、物理及化学性质等方面的鉴定研究。

电泳是一种分离生物大分子物质的常用方法，而电泳分离过程中常用的电泳支持介质是凝胶，例如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。一般情况下，电泳分离核酸分子时使用的凝胶是琼脂糖凝胶，电泳分离蛋白分子时使用的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶。同样浓度的聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶对蛋白和核酸的分离程度是大致相同的，只是聚丙烯酰胺更适合制备浓度较高的凝胶(≥4％)，琼脂糖更适宜制备浓度较低的凝胶(≤4％)，所以聚丙烯酰胺凝胶被用来分离分子量较小的蛋白质，琼脂糖凝胶被用来分离分子量较大的核酸分子。况且，琼脂糖垂直凝胶制备中除了高浓度琼脂糖不易均匀融化外，还存在三个瓶颈问题：一个是黏稠的琼脂糖溶胶如何轻松的灌制进入垂直玻璃板的超窄夹缝中；二是琼脂糖堆叠凝胶的下层凝胶制备时，胶面不能水平，如何保证上层凝胶和下层凝胶交叠面的水平状态；三是选用什么缓冲液在什么电泳条件下进行高浓度琼脂糖堆叠凝胶电泳。由于这些原因，一直以来仅利用中低浓度的琼脂糖凝胶分离大分子量蛋白或蛋白复合物，极大的限制了琼脂糖凝胶电泳在蛋白质分离中的适用范围。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种基于琼脂糖堆叠凝胶的蛋白电泳分离方法，以琼脂糖配合相应的缓冲液，采用层叠的方式制备琼脂糖堆叠垂直凝胶，利用设定的电泳条件，能够在较高浓度条件下利用琼脂糖凝胶对蛋白进行电泳分离，提高了琼脂糖凝胶电泳在蛋白质分离中的适用范围。

本发明所采用的技术方案：

一种基于琼脂糖堆叠凝胶的蛋白电泳分离方法，其步骤如下：

1、凝胶灌制前准备

用Tris-Cl、NaCl配置凝胶缓冲液，浓度分别为0.25M Tris-Cl、0.04～0.2％NaCl，备用；

用Tris-Cl、SDS配置电泳缓冲液，浓度分别为0.25M Tris-Cl、0.2～1.0％SDS，备用；

顶层胶盒的制作：取长方形盒子，其长度略小于玻璃板灌胶器的内孔长度，在盒子底部平行于长边方向开设一个细缝，细缝宽度略大于玻璃板灌胶器的内孔宽度，在盒子底部的外侧于细缝两侧对称设置两条硅胶条，硅胶条之间的距离等于玻璃板灌胶器的厚度。

2、琼脂糖堆叠凝胶灌制：

S1、琼脂糖堆叠凝胶下层凝胶灌制：按浓度为8～14％的琼脂糖溶液的配制标准，将凝胶缓冲液、琼脂糖混合后，在蒸汽环境中于高温、高压的条件下溶解得到澄清的8～14％琼脂糖溶胶，备用；玻璃板灌胶器和顶层胶盒于75～85℃进行预热，然后在75～85℃的环境中将玻璃板灌胶器竖向放置，把顶层胶盒安装在玻璃板灌胶器顶部，顶层胶盒底部的细缝对准玻璃板灌胶器的内孔(玻璃板之间的扁平状孔)，将温度为75～85℃的琼脂糖溶胶倒入顶层胶盒中，待溶胶流满玻璃板灌胶器的内孔后室温放置20～40min，等待溶胶凝固。