[发明专利]用于鉴别木通及其两种混伪品的微滴数字PCR方法及应用

权利要求书

1.用于鉴别木通及其两种混伪品的微滴数字PCR方法及应用，其特征在于，所述方法涉及特异性引物/探针序列及PCR反应体系浓度如表1所示：

表1特异性引物/探针序列及PCR反应体系浓度

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1.提取待检测样品基因组DNA

步骤2.以待检测样品基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异性引物/探针及体系浓度配制木通、关木通、川木通单重或三重微滴数字PCR反应体系并进行扩增；

步骤3.对PCR扩增完成体系进行荧光读数，根据阳性与阴性荧光点数目计算目的片段拷贝数，判断待检测样品是否为或含有木通及其两种常见混伪品。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤1所述待检测样品为任意一种形式的木通、川木通和关木通。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤2木通单重微滴数字PCR反应体系总体积为20μL，包括：10μL ddPCR Supermix for Probe(No dUTP)，0.4μL MT-F，0.4μL MT-R，0.6μL MT-P，1μL待检测样品DNA，7.6μL灭菌蒸馏水。引物和探针初始浓度均为10μM。

5.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤2关木通单重微滴数字PCR反应体系总体积为20μL，包括：10μL ddPCR Supermix for Probe(No dUTP)，0.4μL GMT-F，0.4μL GMT-R，0.2μL GMT-P，1μL待检测样品DNA，8μL灭菌蒸馏水。引物和探针初始浓度均为10μM。

6.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤2川木通单重微滴数字PCR反应体系总体积为20μL，包括：10μL ddPCR Supermix for Probe(No dUTP)，0.4μL CMT-F，0.4μL CMT-R，0.6μL CMT-P，1μL待检测样品DNA，7.6μL灭菌蒸馏水。引物和探针初始浓度均为10μM。

7.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤2三重微滴数字PCR反应体系总体积为20μL，包括：10μL ddPCR Supermix for Probe(No dUTP)，0.6μL MT-F/R，0.45μL MT-P，0.6μLGMT-F/R，0.15μL GMT-P，0.6μL CMT-F/R，0.45μL CMT-P，1μL待检测样品DNA，6.15μL灭菌蒸馏水。引物和探针初始浓度均为10μM。

8.根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤2微滴数字PCR扩增条件参数为：95℃，5min；95℃30s，63℃1min，40个循环；98℃10min。

9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，单重微滴数字PCR方法可分别特异性检测木通、川木通和关木通。

10.根据权利要求2所述方法，其特征在于，基于权利要求1中单重微滴数字PCR体系引物和探针浓度比改变引物和探针浓度，特异性检测木通、川木通和关木通。

11.根据权利要求2所述方法，其特征在于，三重微滴数字PCR方法可以同一反应同时鉴别木通、川木通和关木通。