[发明专利]用于鉴别木通及其两种混伪品的微滴数字PCR方法及应用

说明书

本发明公开了用于鉴别木通及其两种混伪品的微滴数字PCR方法及应用。基于木通及其常见混伪品关木通和川木通的ITS2序列分别设计特异性引物和TaqMan探针，开发单重和三重微滴数字PCR技术。单重微滴数字PCR技术能够分别特异性检测木通、川木通和关木通，三重微滴数字PCR技术可以一次性在同一PCR反应体系中同时检测三种药材，不同引物组之间没有相互干扰，可用于市售木通药材及相关中成药检测。所述特异性引物和TaqMan探针为SEQ ID No.1‑9所示序列。该方法特异性强，灵敏度高，适用于痕量DNA的检测，可为中药质量控制和市场监管提供依据，保证中药安全性及有效性。

技术领域

本发明属于中药材来源鉴定技术领域，具体涉及用于鉴别木通及其两种混伪品的微滴数字PCR方法及应用。

背景技术

《中国药典》收载药材木通为木通科植物木通Akebia quinate(Thunb.)Decne.、三叶木通Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.或白木通Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.var.australis(Diels)Rehd.的干燥藤茎，有“利尿通淋，清心除烦和通经下乳”的功效，广泛用于临床。由于木通资源紧缺，与多种植物藤茎外观相似且存在同名异物等现象，其常见混伪品为毛茛科植物川木通和马兜铃科关木通。其中关木通来源于东北马兜铃(Aristolochia manshuriensis Kom.)，含有第一类致癌物马兜铃酸；川木通来源于小木通(Clematis armandii Franch.)和绣球藤(Clematis montana Buch.-Ham.)，虽同样被收录于《中国药典》，但其与木通在生理特性和功效等方面均存在差异。因此，市售木通药材及含木通中成药的质量控制和监管十分重要。

中成药多处方复杂，通常是借助辅料将多种中药材加工制成丸剂、散剂、片剂和栓剂等，DNA发生不同程度降解且杂质较多，常常难以成功扩增目的片段，常用DNA条形码技术不易从众多药材中鉴别出单个组分。微滴数字PCR方法通过将特异性引物、探针和目的片段分割至独立的扩增体系并产生荧光信号，实现待检测样品的物种来源鉴定。与其他分子技术相比，微滴数字PCR具有较高的PCR抑制剂耐受性，适用于背景信息复杂的DNA检测；扩增目的片段短，DNA降解时仍适用；灵敏度高且可实现绝对定量，适用于痕量DNA检测；无需DNA测序步骤，适用于市场抽检等快速检测。目前，该技术已在鱼类物种分布、病毒检测和转基因成分检测等领域得到广泛应用，但尚未被应用于中药材混伪品鉴定，尤其是深加工产品中的植物源性成分检测，比如中成药。因此，本发明建立可用于木通、川木通和关木通的鉴定方法，以期用于任意一种含有木通的中药质量控制和市场监管，保证中药安全有效。

发明内容

本发明第一个目的在于提供特异性鉴别木通及其两种常见混伪品关木通和川木通的微滴数字PCR引物和探针。

本发明第二个目的在于提供用于分别特异性检测任意形式木通、关木通和川木通的单重微滴数字PCR方法。

本发明第三个目的在于提供用于同时鉴别任意形式中药中木通及其两种常见混伪品的三重微滴数字PCR方法。

本发明提供的木通、关木通和川木通特异性引物/探针的核苷酸序列和微滴数字PCR反应体系浓度如表1所示：

表1 特异性引物/探针序列及微滴数字PCR反应体系浓度

本发明提供的用于鉴别木通及其两种常见混伪品的微滴数字PCR方法，包括如下步骤：

1.提取待检测样品基因组DNA；

2.以待检测样品基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异性引物/探针及体系浓度配制木通、关木通、川木通单重或三重微滴数字PCR反应体系并进行扩增；

3.对PCR扩增完成体系进行荧光读数，根据阳性与阴性荧光点数目计算目的片段拷贝数，判断待检测样品是否为或含有木通及其两种常见混伪品。