[发明专利]一种载体系统和应用及通过其降解目的蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种载体系统和应用及通过其降解目的蛋白的方法。载体系统包括含有目的基因sgRNA及Cas9的表达载体，含有目的基因和生长素诱导降解因子AID的融合表达载体，含有生长素受体—水稻F‑box转运抑制性响应蛋白1OsTIR1的表达载体，以及含有转座酶的表达载体；其中，含有目的基因sgRNA及Cas9的表达载体为分别含有目的基因sgRNA的表达载体和含有Cas9的表达载体，或同时含有目的基因sgRNA和Cas9的表达载体。用生长素处理稳定转染该载体系统的细胞，解决了传统AID系统敲入步骤繁琐、双等位基因插入效率低以及存在基础降解的问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种载体系统和应用及通过其降解目的蛋白的方法。

背景技术

有效地敲除或降解蛋白对于探究目的蛋白在细胞中的功能至关重要。传统的基因敲除方式作用缓慢，对于研究细胞短时间内发生的直接表型变化存在局限性。蛋白质直接降解系统的发展使基因和蛋白质功能的研究变得快捷且直观。其中使用最广泛的是生长素诱导型降解系统（AID系统），可以快速可逆地降解目的蛋白，该系统已被广泛应用于研究真核细胞和模式生物中的基因功能。

AID系统需要表达与内源SCF-E3泛素连接酶复合体相互作用的生长素受体蛋白—水稻F-box转运抑制性响应蛋白1（Oryza sativa F-box transport inhibitor response1,OsTIR1）和带有生长素诱导降解因子（AID）标签的目的蛋白。添加生长素后可介导带有AID标签的目的蛋白与SCF-E3泛素连接酶复合体之间的相互作用，从而导致26S蛋白酶体降解目的蛋白。首先，与传统的基因组编辑技术相比，AID系统避免了基因敲除和RNA干扰（RNAi）的不可逆性，以及不完全沉默和脱靶效应，在特异性、可逆性和降解所需时间方面具有优势。其次，AID系统还避免了基因敲除的次级效应。另外，可逆性和可控性使得表型恢复实验相对简单高效。然而，当前的AID系统存在一些缺陷：（1）需要利用同源臂在内源目的基因C末端插入AID基因，操作繁琐，且双等位基因插入效率低下；（2）内源基因末端插入AID基因后，在添加生长素（IAA）之前即存在不同程度的目的蛋白降解现象（称为基础降解），这会影响对细胞状态与表型相关性的研究。同时，对于一些特别重要的基因，仅基础降解即会导致细胞无法维持，难以获得双插克隆，不适合靶向对细胞维持至关重要的基因；（3）AID系统成功的关键因素是OsTIR1的高稳定表达，将OsTIR1整合在安全位点能够保证其足够的表达量，但是，靶向安全位点的缺点是实验操作繁琐、表达水平受限并且在细胞分化中可能沉默。因此，需要寻找一种新的AID系统的构建方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种新的基于CRISPR/Cas9和AID系统联合的载体系统，并提供了一种应用该载体系统一步降解目的蛋白的简便方法，解决了传统AID系统敲入步骤繁琐、双等位基因插入效率低以及存在基础降解的问题。

本发明的第一个目的是提供一种载体系统，该载体系统包括：含有目的基因sgRNA（single guide RNA）及Cas9的表达载体，含有目的基因和AID的融合表达载体，含有OsTIR1的表达载体，以及含有转座酶的表达载体；

其中，含有目的基因sgRNA及Cas9的表达载体为：分别含有目的基因sgRNA的表达载体和含有Cas9的表达载体，或同时含有目的基因sgRNA和Cas9的表达载体。

进一步地，含有目的基因sgRNA的表达载体包括pGL3载体或PX330载体，以及连接在pGL3载体或PX330载体上的靶向目的基因的sgRNA。当然，本领域技术人员可以采用其他的含有目的基因sgRNA的表达载体，以及报道过的CRISPR/Cas9质粒系统。