[发明专利]一种双峰驼的精液冷冻方法

说明书

本发明公开了一种双峰驼的精液冷冻方法，包括：采集的精液与液化液按照1:1稀释，保存在37℃恒温箱中使其充分液化；取充分液化后的精液进行镜检，评定精子活力；精子活力合格的精液离心处理，弃去上清液；加冷冻液，与弃去上清液的精液充分混合；将与冷冻液充分混合的精液分装在多个0.5mL的细管中；把装有精液的细管放入避光容器中，缓慢降温至4℃平衡；平衡后的精液放入4℃的冷冻架上；装有精液的细管置于液氮面上方熏蒸，然后将细管放入液氮液中冷冻。利用液氮之前精液多在37℃或4℃左右的环境中，不会使精子活性下降，而在将精液放入液氮液(装有精液的细管放入液氮液中)后即可实现精液的冷冻，从而保证精子活性。

技术领域

本发明涉及人工授精技术领域，具体涉及一种双峰驼的精液冷冻方法。

背景技术

双峰驼是国家Ⅰ级重点保护动物，列入《中国物种红色名录》和《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》，目前有野生双峰驼和家养双峰驼。由于繁殖速度较慢，世界范围内的野生双峰驼的种群数量仍在继续下降。我国的家养双峰驼主要分布在西北和华北北部等区域，主要采用人工受精技术保证家养双峰驼的繁殖速度。目前关于双峰驼人工采精后的精液冷冻技术披露极少，传统的双峰驼精液冷冻方法会影响到精子活力，并且出现头对头现象。亟需研究出一种新的关于双峰驼的人工采精后的精液冷冻方法，不影响精子活力。

发明内容

为此，本发明提供一种双峰驼的精液冷冻方法，以解决上述的技术问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种双峰驼的精液冷冻方法，包括：

采集的精液与液化液按照1:1稀释，保存在37℃恒温箱中一段时间，期间不断用移液器轻轻抽取混合液使其充分液化；

取充分液化后的精液进行镜检，评定精子活力；

精子活力合格的精液离心处理，弃去上清液；

加冷冻液，与弃去上清液的精液充分混合；

将与冷冻液充分混合的精液分装在多个0.5mL的细管中，并封闭细管的端口；

把装有精液的细管放入避光容器中，缓慢降温至4℃，平衡一段时间；

平衡后的精液放入4℃的冷冻架上；

装有精液的细管置于液氮面上方熏蒸一段时间，然后将细管放入液氮液中冷冻。

进一步地，精液稀释前，将需与精液接触的器皿以及液化液放在37℃恒温箱中备用，将冷冻液置于室温备用。

进一步地，精液稀释前，将采集的精液进行镜检；镜检合格的精液与液化液按照1:1稀释，然后保存在37℃恒温箱中30min，期间不断用移液器轻轻抽取混合液使其充分液化；每隔5分钟，观察液化情况，待完全液化，用血细胞计观察精子浓度。

进一步地，评定精子活力时，取一滴充分液化的精液于载玻片上，加盖盖玻片后在38℃恒温装置的显微镜上评定活力。

进一步地，离心处理时，对精子活力合格的精液离心处理10min。

进一步地，所述液化液包括9.6mLTCF溶液和0.4mL蛋黄，其中，TCF包括36.34gTris、19.89g柠檬酸、5g果糖、2.92gEDTA、0.5gBSA、10万单位青霉素、10万单位链霉素和800mL超纯水。

进一步地，加冷冻液时，根据精液密度按比例加入冷冻液A，用移液器缓慢抽取混合液使精液充分与冷冻液A混合，置于4-5℃环境中平衡2h；然后加入冷冻液B，充分混匀，其中，冷冻液A和冷冻液B的比例为1:1。