[发明专利]一种磁珠-DNA探针、MC-LR检测生物传感器及制备方法与应用

说明书

本发明属于生物传感器及环境监测领域，公开了一种磁珠‑DNA探针、MC‑LR检测生物传感器及制备方法与应用。本发明生物传感器包括磁珠‑DNA探针、Cas12a‑crRNA和信号链Reporter。当MC‑LR存在时，的DNA双链Probe上的DNA双链Probe中的Blocker链与MC‑LR竞争结合Aptamer，进而释放Blocker链，释放的Blocker链来激活Cas12a‑crRNA，Cas12a核酸酶被激活后，可非特异性切断信号链Reporter链，产生荧光。该生物传感器对MC‑LR具有高特异性和灵敏性，并且成本低廉，可用于真实环境水样的检测。

技术领域

本发明属于生物传感器及环境监测领域，具体涉及一种磁珠-DNA探针、MC-LR检测生物传感器及制备方法与应用。

背景技术

随着水体富营养化的逐步加剧，蓝藻水华和赤潮的发生逐步增加。越来越多的水源受到蓝藻水华的次生代谢产物-微囊藻毒素(MCs)的污染，对水体环境和人群健康构成巨大的威胁。而MC-LR是其中最普遍、最具毒性的微囊藻毒素同源物，能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，还是强烈的肝脏肿瘤促进剂。考虑到其强毒性，中国生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)的颁布，将饮用水中微囊藻毒素含量限制为1μg/L。因此，在水环境中监测MC-LR对环境安全与人体健康至关重要。

检测MC-LR的传统方法包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱与质谱联用(LC-MS)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白磷酸酶抑制试验(PPIA)、以及光学和电化学传感器。HPLC-MS虽然有较高的灵敏度和特异性，但是其需要庞大而昂贵的机器设备，这对现场检测MC-LR造成了一定的阻碍。ELISA和PPIA虽然利用了酶的特异性，然而其需要多步骤冗长的检测过程。电化学传感器虽然有极灵敏的检测效果，但是需要合适的电极材料以及适宜的电极修饰。光学传感器操作简单，但是也受到了灵敏度和特异性的限制。

通过查阅文献知道，原核生物已经开发出一种成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)的适应性免疫系统。过去的几年里，CRISPR-Cas9酶经过各种重新设计，引起了基因编辑热潮。而CRISPR-Cas12a是一种新的RNA引导的核酸酶，正在成为基因编辑最常用的工具，其对DNA识别的特异性、灵敏性和可编程性在分子诊断领域备受关注，做为一些强大诊断工具的核心，其有望解决生物传感器在灵敏度和特异性等方面的问题。

传统的抗原-抗体反应灵敏度、特异性均好，但是蛋白质做为探针分子容易变性，而且价格昂贵，适配体由DNA分子构成，经SELEX富集筛选，可以具有与抗原-抗体相匹敌的灵敏度，同时更易合成，稳定性更好。所以我们在生物传感器的基础上，结合DNA适配体的特异性、酶的特异性，构建出一种操作简单同时高灵敏度的MC-LR检测平台，同时通过对信号链的设计，利用侧向流动试纸条直接检测MC-LR，操作简单，省去现场检测时机器设备带来的不便。

发明内容

本发明要解决的技术问题是构建一种可现场检测MC-LR的磁珠-DNA探针、包含该磁珠-DNA探针的生物传感器，该生物传感器具有高特异性和灵敏性，并且成本低廉，操作步骤简便。

本发明提供了一种磁珠-DNA探针，所述磁珠-DNA探针由适配体Aptamer和其互补链Blocker结合得到的DNA双链Probe结合在链霉亲和素磁珠表面所构成，所述链霉亲和素磁珠为表面偶联有链霉亲和素的磁珠，所述适配体Aptamer的序列如SEQ NO.1所示，所述适配体Aptamer的5’端连接生物素-Biotin，所述互补链Blocker的序列如SEQ NO.2所示。

进一步的，上述磁珠-DNA探针的制备方法，包括以下步骤：

a)将适配体Aptamer和互补链Blocker加入TAMg缓冲液中混合摇匀得反应液，将所述反应液95℃加热5min，然后逐渐冷却至4℃，形成DNA双链Probe；所述反应液中，Aptamer的浓度优选为1v/v％，Blocker的浓度优选为1v/v％。