[发明专利]一种提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法

权利要求书

1.一种提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，所述提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法包括以下步骤：

步骤一，以α-丁酮酸为底物，通过分子对接预测可突变位点，进行TD转化液的配置；

步骤二，构建突变体；将构建的突变体质粒进行测序验证，我们得到了需要构建的突变体，对构建好的突变体质粒进行BL21(DE3)的表达，该菌株为表达常用菌株，已公开应用，通过TLC检测筛选出活性高于野生型的突变体；

步骤三，对活性高于野生型的突变体进行表达纯化，以纯酶测酶活，进行突变体酶活初筛；

步骤四，进行OATA野生型及突变体酶活比较、OATA组合突变酶活比较。

2.如权利要求1所述的提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，步骤一中，所述通过分子对接技术进行TD转化液的配置，包括：

(1)以α-丁酮酸为底物，通过分子对接技术，在参与OATA与底物相互作用的氨基酸残基中，选择6个相关位点进行饱和突变；

(2)用50mM的磷酸钾缓冲液配置含300mM苏氨酸和450mM异丙胺的底物，用6M HCl调pH到7.5；

(3)用50mM的磷酸钾定容到500mL，向其中加入5g/L的苏氨酸脱氨酶TD的发酵菌体，于37℃，220rpm摇床反应4h，菌体来源于大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，该菌株为表达常用菌株；

(4)反应完后，用TLC进行快速检测，底物苏氨酸反应完全，再用10000rpm离心25min，收集反应上清，即得到TD转化液，4℃保存待用。

3.如权利要求2所述的提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，所述6个相关位点为：Y20，L57，W58，G229，A230，M419。

4.如权利要求1所述的提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，步骤二中，所述突变体的构建方法，包括：

(1)以pET28a-OATA质粒为模板，通过设计引物对载体进行反扩，对反扩的载体进行DpnI处理；

(2)进行T5外切酶介导的同源重组，重组片段转化DH5α感受态，涂布含50μg/mL kana的LB平板，于37℃培养箱培养12-14h；

(3)每个平板挑取两个单菌落接种到700μl的含50μg/mL kana的LB液体培养基，37℃，220rpm培养5-6h后送生工进行测序。

5.如权利要求1所述的提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，步骤二中，所述通过TLC检测筛选出活性高于野生型的突变体，包括：

(1)将构建好的突变体及野生型质粒转入BL21，待长出单菌落后，接入到5mL含50μg/mLkana的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养；

(2)待OD600到0.6-0.8时，加入终浓度1mM的IPTG，于18℃诱导12h；

(3)诱导后，调整野生型及突变体的OD600到3，用配置好的TD转化液为底物，200μL的体系，于37℃，220rpm反应2h；

(4)通过TLC进行快速检测，筛选出活性高于野生型的突变体。

6.如权利要求5所述的提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法，其特征在于，所述层析液的配置方法，包括：

1)甲液配置：4g茚三酮溶于400ml正丁醇中，在常温用磁力搅拌器溶解；

2)乙液配置：100mL冰醋酸和200mL蒸馏水混合，甲乙液分开，于4℃保存；使用时，甲液：乙液＝4：3。