[发明专利]一种提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法

说明书

本发明属于L‑2‑氨基丁酸合成技术领域，公开了一种提高L‑2‑氨基丁酸合成速率的方法，以α‑丁酮酸为底物，通过分子对接技术进行ω‑转氨酶的分子改造，用配置的TD转化液进行活性筛选；构建突变体；通过TLC检测筛选出活性高于野生型的突变体；对活性高于野生型的突变体进行表达纯化，以纯酶测酶活，进行突变体酶活初筛；进行OATA野生型及突变体的酶活比较、OATA组合突变及酶活比较。本发明基于半理性设计，通过对ω‑转氨酶的改造，利用分子对接选取OATA活性位点周围的六个位点，通过单点饱和突变及组合突变，筛选出活性提高3.2倍的突变体L57C/M419I，为OATA的应用提供强有力支持。

技术领域

本发明属于L-2-氨基丁酸合成技术领域，尤其涉及一种提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法。

背景技术

目前，L-2-氨基丁酸作为一种非天然氨基酸，可以抑制神经信息的传递，同时可以提高葡萄糖磷酸酯酶的活性，加速脑细胞代谢，作为抗癫痫和抗结核的药物中间体，具有非常好的药理活性。ω-转氨酶是一种磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶，可以不对称合成手性胺。

OATA是一种来源于苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)的ω-转氨酶，该酶可以利用α-丁酮酸和异丙胺作为底物，合成L-2-氨基丁酸。然而OATA的催化效率较低，难以适应工业生产要求，现如今ω-转氨酶的研究十分火热，通过对其分子进行改造以提高酶活是一种重要的解决方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：L-2-氨基丁酸生产方法包括化学合成法和生物合成法，化学合成法价格高昂同时容易造成环境污染，不利于工业应用，相比之下，生物合成法绿色无污染，更适合L-2-氨基丁酸的绿色合成。现有OATA的催化效率较低，难以适应工业生产要求。

解决以上问题的难度：酶的定向进化具有盲目性，经过多轮长期筛选不一定能选出活性提高的突变体。

解决以上问题及缺陷的意义为：筛选出活性提高的突变体，对于工业生产能节约很大成本。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法，尤其涉及一种基于ω-转氨酶的改造以提高L-2-氨基丁酸的合成速率的方法。

本发明是这样实现的，一种提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法，所述提高L-2-氨基丁酸合成速率的方法包括以下步骤：

步骤一，以α-丁酮酸为底物，通过分子对接预测可突变位点，进行TD转化液的配置；

步骤二，构建突变体；通过TLC检测筛选出活性高于野生型的突变体；

步骤三，对活性高于野生型的突变体进行表达纯化，以纯酶测酶活，进行突变体酶活初筛；

步骤四，进行OATA野生型及突变体酶活比较、OATA组合突变酶活比较。进一步，步骤一中，所述通过分子对接技术进行TD转化液的配置，包括：

(1)以α-丁酮酸为底物，通过分子对接技术，在参与OATA与底物相互作用的氨基酸残基中，选择6个相关位点进行饱和突变；

(2)用50mM的磷酸钾缓冲液配置含300mM苏氨酸和450mM异丙胺的底物，用6M HCl调pH到7.5；

(3)用50mM的磷酸钾定容到500mL，向其中加入5g/L的苏氨酸脱氨酶TD的发酵菌体，于37℃，220rpm摇床反应4h；

(4)反应完后，用TLC进行快速检测，底物苏氨酸反应完全，再用10000rpm离心25min，收集反应上清，即得到TD转化液，4℃保存待用。

进一步，所述6个相关位点为：Y20，L57，W58，G229，A230，M419。

进一步，步骤二中，所述突变体的构建方法，包括：