[发明专利]一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液，其特征在于，所述酶解液包括以下组分：纤维素酶20g/L、离析酶5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7～0.8mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl₂ 20mmol/L和BSA 1g/L～3g/L；所述纤维素酶的酶活为10000U/g；所述离析酶的酶活为3000U/g。

2.根据权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述酶解液包括以下组分：纤维素酶20g/L、离析酶5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl₂ 20mmol/L和BSA1g/L；所述纤维素酶的酶活为10000U/g；所述离析酶的酶活为3000U/g。

3.权利要求1或2所述酶解液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将纤维素酶、离析酶、MES、甘露醇和KCl混合，55℃水浴10min，得到混合液；混合液降温至20～25℃后，将混合液和CaCl₂及BSA混合，得到所述酶解液。

4.权利要求1或2所述酶解液或利用权利要求3所述制备方法制备得到的酶解液在制备蓝果忍冬原生质体中的应用。

5.一种制备蓝果忍冬植物原生质体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将蓝果忍冬叶片和权利要求1或2所述酶解液或利用权利要求3所述制备方法制备得到的酶解液混合，暗处理3h，得到混合液；

将所述混合液与W5溶液混合，过滤，将得到的滤液离心，得到沉淀为原生质体；所述W5溶液包括以下组分：MES 2mmol/L、NaCl 9g/L、CaCl₂ 0.1mol/L和KCl 5mmol/L；所述W5溶液的pH值为5.8。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蓝果忍冬植物叶片和权利要求1或2所述酶解液混合后还包括抽真空30min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述暗处理的温度为20～25℃。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心的方法包括：将滤液在离心力为100g下离心2min，得到初级沉淀；

将初级沉淀与所述W5溶液混合，在离心力为100g下离心10min，得到的沉淀为原生质体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述初级沉淀与所述W5溶液混合后还包括将混合液在冰上静置30min。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，得到原生质体后还包括：将原生质体与MMG溶液混合，得到含有原生质体的混合液；所述MMG溶液包括以下组分：甘露醇0.4mol/L、MgCl₂ 0.015mol/L和MES 4mmol/L；所述MMG溶液的pH值为5.7。