[发明专利]一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及植物原生质体技术领域，特别是涉及一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用。本发明以蓝果忍冬叶片为材料制备原生质体，针对蓝果忍冬的种属特点以及叶片的结构等特点，通过适宜的组分复配得到一种适宜蓝果忍冬的酶解液。本发明提供的酶解液可以显著提高制备得到的蓝果忍冬的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性。另外，本发明提供的酶解液将有助于蓝果忍冬原生质体融合育种的实施，为基于细胞融合和基因转化的蓝果忍冬细胞工程育种和分子生物学研究提供重要材料，具有较大的应用价值。

技术领域

本发明涉及植物原生质体技术领域，特别是涉及一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用。

背景技术

蓝果忍冬(Lonicera caerulea L.)是忍冬科忍冬属的一种多年生落叶灌木，生于落叶林下或林缘荫处灌丛中，广泛分布于我国各地。蓝果忍冬作为第三代新兴小浆果树种，其浆果富含氨基酸、矿物质、糖类、维生素和多种活性物质，可生食，营养价值丰富，具有极高的药用价值和经济价值，是一种纯天然的保健产品。

植物原生质体是指去除细胞壁后的活细胞，具有全能性，在一定条件下可再生细胞壁并再生成新植株。由于其无细胞壁障碍的特性，常被用来作为细胞融合和体细胞杂交等研究的理想材料，能有效克服种、属间的不亲和障碍。此外，原生质体能够摄取DNA、病毒、细菌等外源物质，因此也被广泛应用于亚细胞定位、筛选突变体、基因瞬时表达和蛋白互作等分子生物学方面的研究。近些年来，对蓝果忍冬植物的研究主要集中在药理药效以及化学成分分析等方面，而生物技术在蓝果忍冬植物研究中的应用起步较晚，多个领域的研究还比较缺乏。目前为止，对于蓝果忍冬原生质体分离、培养以及融合等方面的研究尚属空白。

由于不同植物的细胞结构等存在较大差异，采用其他植物的原生质体分离方法进行蓝果忍冬叶片的处理，较难得到较高的原生质体数量，且得到的原生质体的完整性和活性也不佳。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液及其制备方法和应用。本发明提供的酶解液可以显著提高制备得到的蓝果忍冬的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种制备蓝果忍冬原生质体的酶解液，所述酶解液包括以下组分：纤维素酶20g/L、离析酶5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7～0.8mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl₂20mmol/L和BSA 1g/L～3g/L；所述纤维素酶的酶活为10000U/g；所述离析酶的酶活为3000U/g。

优选的，所述酶解液包括以下组分：纤维素酶20g/L、离析酶5g/L、MES 20mmol/L、甘露醇0.7mol/L、KCl 20mmol/L、CaCl₂20mmol/L和BSA 1g/L；所述纤维素酶的酶活为10000U/g；所述离析酶的酶活为3000U/g。

本发明还提供了上述酶解液的制备方法，包括以下步骤：将纤维素酶、离析酶、MES、甘露醇和KCl混合，55℃水浴10min，得到混合液；混合液降温至20～25℃后，将混合液和CaCl₂及BSA混合，得到所述酶解液。

本发明还提供了上述酶解液或利用上述制备方法制备得到的酶解液在制备蓝果忍冬原生质体中的应用。

本发明还提供了一种制备蓝果忍冬植物原生质体的方法，包括以下步骤：

将蓝果忍冬叶片和上述酶解液或利用上述制备方法制备得到的酶解液混合，暗处理3h，得到混合液；

将所述混合液与W5溶液混合，过滤，将得到的滤液离心，得到沉淀为原生质体；所述W5溶液包括以下组分：MES 2mmol/L、NaCl 9g/L、CaCl₂0.1mol/L和KCl 5mmol/L；所述W5溶液的pH值为5.8。