[发明专利]一种鉴定水稻Badh2基因型的引物组、方法和试剂盒

说明书

本申请涉及鉴定水稻Badh2基因型的引物组，所述引物组包括(1)上游引物exon7‑2‑F和任选地选自以下的下游引物Xiang7R、intron7R、INTRON8R1或INTRON8R2；或者(2)引物组BADH2G‑F、BADH2G‑1R和badh2G‑2R。引物的具体序列如说明书定义。本申请还涉及用于鉴定水稻Badh2基因型的方法和试剂盒。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种鉴定水稻Badh2基因两种基因型的引物组、方法和试剂盒。

背景技术

随着生活水平的提高，人们对稻米食味品质及风味(口感和香味)的要求越来越高。香稻因其具有香气馥郁、米饭芬芳等特点，深受广大消费者的喜爱(Bradbury et al.,2005；Myint et al., 2012)。

鉴定香稻的常规方法是通过KOH浸泡叶片闻味，或者咀嚼稻米，确定香味。在选育香稻的过程中，子代数量很多，劳动量大。

前人对水稻香味的遗传研究认为水稻香味是由单个隐性基因控制的，精细定位及图位克隆研究表明水稻第8号染色体上的甜菜碱醛脱氢酶2基因 (betaine aldehydedehydrogenase homologue 2,Badh2)与香味密切相关(Ahn et al.,1992；Lorieux etal.,1996；Bradbury et al.,2005)。研究表明，非香型水稻中的Badh2基因为显性，香型水稻(香稻)中的badh2基因是隐性的。

通过对各地香稻资源的研究发现，Badh2基因存在多种等位型，其中最常见的类型是Badh2基因的第7外显子有1个8bp的缺失和3个单核苷酸多态性位点(图1，缺失用“.”表示，单核苷酸多态性用灰色表示)。市场上的香稻的基因型多为此基因型，因此需要相应的分子标记用于检测香稻和非香稻的基因型。

目前已有一些针对Badh2基因的第7外显子的缺失设计的引物，用于区分香型与非香型水稻Badh2基因型。利用这些引物扩增得到的PCR片段仅相差8bp，故需要用高浓度的琼脂糖(3％)或者6％聚丙烯酰胺电泳进行区分。高浓度的琼脂糖(3％)或者6％聚丙烯酰胺电泳的缺点在于制作过程复杂，电泳时间长，条带不易区分。以利用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳为例，制备凝胶耗时约3小时，并且由于待测片段的差异仅有8bp，需要电泳1.5-2h，然后需要染色1h左右，总计耗时需要4-5小时。

Louis M.T.Bradbury等人(Louis M.T.Bradbury et al.,2005)公开了一组用于分析水稻香型的引物，包括外部正向(ESP)、外部反向(EAP)、内部香味反向(IFAP)和内部非香味正向(INSP)4种引物。由于该方法在同一个反应中用四个引物同时扩增，劳动强度大，且对于扩增条件要求较高，例如需要准确控制引物的浓度、退火温度等条件，否则可能导致实验失败(即无扩增条带)。

发明内容

为了更容易地区分Badh2基因型，发明人设计了一种针对水稻Badh2基因外显子7的引物exon7-2-F。发明人将香稻与非香稻中的差异序列 AAAAGATTATGGC设计在上游引物的3’端，以此引物与下游引物进行扩增时，非香稻(即含有Badh2基因)可以扩增得到280bp的目的条带，香稻(含有badh2基因)无条带。

发明人还设计了一组引物，包括一条上游引物和两条下游引物，使得来自非香稻的DNA模板能扩增出两条条带，而来自香稻的DNA模板只能扩增出一条条带。

电泳检测时，用1％-2％的琼脂糖凝胶即可区分扩增产物。1％-2％的琼脂糖凝胶的制作比高浓度的琼脂糖(3％)或者6％聚丙烯酰胺凝胶容易、便利。