[发明专利]联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括扩增17个基因座的特异性引物。与现有技术相比，本发明具有以下优点：克服MLPA检测平台操作复杂、耗时长、检测成本高；qPCR检测平台检测通量小、单拷贝鉴定不够准确等问题，本发明选用多重荧光PCR平台结合拷贝数校准内标并结合毛细管电泳的技术平台，建立了可同时检测SMN1、SMN2全部外显子及5处“2+0”型携带者相关性SNP位点的准确区分SMA健康人群、携带者及患者的检测方法。为SMA的诊断提供更加便捷、准确、高性价比的选择方案。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种可应用于SMA患者、携带者及健康人群的SMN基因拷贝数的准确测定，为后续选择治疗方案、指导优生优育提供可靠的参考资料；具体为联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒及其应用。

背景技术

脊髓性肌肉萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)又称脊肌萎缩症，是一类由脊髓前角运动神经元变性导致肌无力、肌萎缩的疾病。属常染色体(5q13.2)隐性遗传病，临床分为SMA-Ⅰ型(婴儿型)、SMA-Ⅱ型(中间型)、SMA-Ⅲ型(青少年型)、SMA-Ⅳ型(成人型)。

Ⅰ型患者在出生时或在6个月之内发病，不能独立坐或走，通常在两年内死于呼吸功能不全；Ⅱ型患者在6个月之后发病，可独力坐，但在没有辅助设备帮助的情况下无法行走，寿命会大幅缩短；Ⅲ型患者通常在1岁半后发病，能够独立坐或走，但在青春期或成人后行走能力有所减退，需要依靠轮椅行动；Ⅳ型患者多为青年后发病，共同特点是脊髓前角细胞变性，临床表现为进行性、对称性、肢体近端为主的广泛性弛缓性麻痹与肌萎缩。各型区别根据起病年龄、病情进展速度、肌无力程度及存活时间长短而定，智力发育及感觉均正常。

遗传学研究已经确定SMA与5号染色体上高度同源的SMN1和SMN2基因密切相关。一般健康个体有2拷贝的SMN1基因与2拷贝的SMN2基因。若某一个体2拷贝的SMN1基因都失去功能的就会患病，只有1拷贝SMN1基因起作用的个体为携带者。在SMN1基因都失去功能的情况下个体被判定为患者，此时SMN2基因拷贝数数目会影响患者的发病时间与病情严重程度。拷贝数越多，越晚发病且病程发展越缓慢。明确的致病机理为核酸筛查提供了有力的技术保障。

2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，脊髓性肌萎缩症(人群中的携带率1/35～1/50，发病率1/6000～1/10000)因其高致死性、高携带率、低发病率的特点被收录其中。

SMA早期症状不明显一旦发病无有效治疗手段，给患者家庭带来心理和经济上沉重的双重打击。目前仅3种药物(Spinraza、Zolgensma、Risdiplam)有对部分特定SMA患者有缓解病程或治疗的作用，但是均价格昂贵且有极高的治疗风险，其中全球最贵药物Zolgensma(由诺华制药Novartis开发，单剂次超210万美元)就在其中。而在国内获批上市的Spinraza、Risdiplam也需要患者终身服药，每年也需要金额不小的费用。

故针对SMA致病基因进行检测可以说是性价比最高且最有效的防治手段，即从婚前、孕前、家族病史患者等层面进行SMA携带者及患者筛查，可以指导优生优育，进行孕前干预，从根源上降低患儿的出生率，进而减少社会及患者家庭的创伤和压力。

目前诊断SMA的“金标准”是荷兰MRC-Holland公司使用MLPA技术平台的P021和P460(产品编号)，不光检测位点多、覆盖信息全面；而且可以进行准确的拷贝数测定。同时也获得了全球最广泛的认可及使用，P021拥有欧盟认证CE、以色列认证IL及摩洛哥认证MA；P460拥有欧盟认证CE。但MLPA检测平台也存在操作复杂、检测耗时长、检测成本高等缺点。