[发明专利]新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供了一种新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括数字PCR反应液、检测ORF1ab基因和N基因片段的引物及探针、阳性对照品和阴性对照品，ORF1ab基因的检测引物正向序列为：SEQ ID NO.1，反向序列为：SEQ ID NO.2，探针序列为：SEQ ID NO.3；N基因的检测引物正向序列为：SEQ ID NO.5，反向序列为：SEQ ID NO.6，探针序列为：SEQ ID NO.7；本发明通过特定的数字PCR引物和探针序列，可对样本进行定量检测，从而可实现新型冠状病毒高灵敏度、高特异性检测，为新型冠状病毒的感染提供辅助诊断。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 19，COVID-19)是由2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的一种急性呼吸道传染病。自COVID-19暴发以来，疫情快速席卷全球，对全球公共卫生及经济发展造成了严重影响，根据世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)报告，截至2021年11月1日，全球已确诊COVID-19感染4525497例，死亡307395例，其传染性远超严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)，危害极其严重。由于感染者早期症状不明显且存在无症状感染者，极易造成漏诊或误诊，因此早期、精准检测出病原体对于病毒的确诊、治疗与预后监测十分重要。

实时荧光定量PCR作为新型冠状病毒感染检测金标准，是实验室目前最常用的检测方法。疫情发生后，中国疾控在内的多家机构发布了各自扩增序列和引物探针序列，涵盖了ORF1ab基因、N基因、E基因等。现在临床上使用的绝大多数试剂盒检测灵敏度在10²拷贝范围内，而且受条件限制，现有的qPCR方法只能对新型冠状病毒进行定性检测。并且由于多例出院后的病人核酸复检呈现阳性的情况，很有可能说明是由于病毒载量太低而未达到qPCR检出限导致阴性误判，所以提高病毒核酸检测灵敏度是亟待解决的问题。

数字PCR比传统的qPCR具有更高的灵敏度和准确性，最低能够检测出单个拷贝数的样本。数字PCR是将反应液生成数万个单独的微滴反应，核酸分布其中，并在每个单独的微滴反应中进行单分子扩增，从而实现绝对定量。作为灵敏度最高的技术，数字PCR已证明了它在绝对量化等应用中的可靠性，目前已成熟应用于如液体活检中肿瘤导致的突变、基因表达和microRNA定量检测、拷贝数变异(CNV)等。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒。

本发明的次要目的是提供数字PCR检测试剂盒检测新型冠状病毒的方法。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种新型冠状病毒的数字PCR检测试剂盒，其包括数字PCR反应液、检测ORF1ab基因和N基因片段的引物及探针、阳性对照品和阴性对照品。

其中，ORF1ab基因的检测引物正向序列为：ATGGCTACATACTACTTATTTG(SEQ IDNO.1)，反向序列为：GCTCAAACTCTTCTTCTTC(SEQ ID NO.2)，探针序列为：FAM-TCACCTTCTTCTTCATCCTCATCTGG-BHQ1(SEQ ID NO.3)。

N基因的检测引物正向序列为：GCAACAGTTCAAGAAATTC(SEQ ID NO.5)，反向序列为：CTGGTTCAATCTGTCAAG(SEQ ID NO.6)，探针序列为：VIC-AAGCAAGAGCAGCATCACCG-BHQ1(SEQ ID NO.7)。