[发明专利]一种基于四面体框架核酸的复合佐剂、mRNA疫苗及其制备方法和用途

说明书

本发明提供了一种CpG‑tFNA和mDF2β的复合佐剂，以及基于该复合佐剂的mRNA纳米疫苗；mRNA在没有佐剂的情况下几乎不会进入细胞发挥功能，而使用本发明复合佐剂的mRNA纳米疫苗不但生物安全性好，而且可被树突状细胞内化并促进其成熟，成熟的树突状细胞分泌细胞因子并在细胞膜上表达共刺激分子，随后迁移并与T细胞接触以进行抗原呈递；活化的抗原特异性CD8+T细胞迁移至外周，浸润早期肿瘤组织，识别和攻击肿瘤细胞，最终抑制肿瘤的发生和生长，两种佐剂复合起到了协同增效作用，比仅使用一种佐剂的mRNA纳米疫苗具有更好的效果，应用前景优异。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于四面体框架核酸的复合佐剂、mRNA疫苗及其制备方法和用途。

背景技术

核酸疫苗，包括DNA和RNA疫苗，在多类疾病的预防和治疗中显示出巨大的前景。人工体外合成的DNA或RNA被运输到细胞中，通过转录和/或翻译，最终形成内源性抗原。与减毒疫苗或肽疫苗相比，核酸疫苗的关键优势在于它们优先刺激细胞免疫而不是体液免疫。这是因为内源性抗原由MHC(major histocompatibility complex)-1类分子介导抗原呈递，导致CD8阳性T细胞的活化，从而促进细胞免疫。这对于肿瘤和病毒的免疫治疗尤其重要。此外，核酸序列易于体外扩增，使得快速量产核酸疫苗的可行性较高，因此尤其适用于突发性传染疾病。

核酸疫苗中的mRNA疫苗通常在蛋白质翻译后受到降解，具有很高的生物安全性。目前已有较多研究意识到了mRNA疫苗的优点，并在初期临床阶段成功验证了mRNA疫苗的功效。例如新型冠状病毒的mRNA疫苗已被批准用于开发和全球应用。此外，诸多mRNA疫苗正在针对多种肿瘤进行临床试验，如黑色素瘤和前列腺癌。

但是，mRNA疫苗的广泛应用仍然面临挑战。mRNA是核苷酸的长链状聚合物，带负电荷，若没有载体递送，易导致细胞通透性差。此外，单链mRNA的稳定性较差，人工合成时通常需要特定核酸(例如5-甲基胞苷)的修饰以提高稳定性。然而，这一类的修饰往往降低了mRNA自身的佐剂效应，从而削弱了对抗原呈递细胞的活化的刺激能力。目前，脂质体载体被广泛使用于mRNA的递送。除了递送mRNA外，脂质体还能够通过共同递送佐剂或者自身的化学修饰以增强免疫刺激性。美中不足的是，这类载体具有一系列潜在缺点，例如体内毒性，对抗原呈递细胞缺乏靶向性，以及难以共同递送多种佐剂。对于mRNA药物而言，理想的载体及佐剂应至少满足以下特征：(1)增强mRNA的递送；(2)有效激活免疫细胞，尤其是抗原呈递细胞；(3)优先诱导细胞免疫而非体液免疫；(4)非特异性免疫低；(5)不引起体内毒性；但目前兼具上述优异特性的mRNA疫苗佐剂还鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于四面体框架核酸的新型复合佐剂。

本发明提供了一种复合佐剂，它由连接有CpG的DNA四面体CpG-tFNA和mDF2β复合而成；

所述DNA四面体由4条DNA单链自组装形成，

所述CpG连接于4条DNA单链中至少一条单链的5’端。

进一步地，上述CpG的序列如SEQ ID NO.1所示，和/或所述DNA四面体的4条DNA单链的序列分别一对一地选自SEQ ID NO.2～5的所述序列。

更进一步地，上述CpG连接于4条DNA单链的5’端；

优选地，所述CpG与DNA单链通过连接序列TTTTT连接，所述4条DNA单链连接CpG后的序列如SEQ ID NO.6～9所示。

更进一步地，上述CpG-tFNA和mDF2β的摩尔比为1:(200～500)，优选为1:300。

更进一步地，上述CpG-tFNA由如下方法制备而成：将DNA四面体的4条DNA单链置于足以使其变性的温度下维持至少10min，再将温度降低到2～8℃维持至少20min；所述4条DNA单链中至少一条的5’端连接有CpG。