[发明专利]LAMP检测OXA48家族基因的引物组合物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种LAMP检测耐碳青霉烯酶阴沟肠杆菌OXA48家族基因的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法，选择OXA48家族的共同基因片段，其中包含bla_OXA‑48、bla_OXA‑181、bla_OXA‑232、bla_OXA‑204、bla_OXA‑162、bla_OXA‑244，设计环介导等温扩增体系中所需引物，对反应体系、反应条件以及染色剂浓度等进行反复优化，建立改良的OXA48家族LAMP检测的试剂盒。该LAMP检测试剂盒不仅可以检测阴沟肠杆菌的OXA48家族基因，还可以推及其他细菌，只要含有该耐药基因的细菌均可以检测到。由于LAMP检测试剂盒操作简便，操作风险低。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，涉及一种引物组合物、试剂盒和检测方法，具体地说是一种LAMP检测耐碳青霉烯酶阴沟肠杆菌OXA48家族基因的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法。

背景技术

肠杆菌科细菌是社区和医院感染中的常见病原菌之一，20世纪80年代以来，碳青霉烯类抗菌药物一直被认为是对抗产超广谱β－内酰胺酶(ESBLS)和AmpC酶肠杆菌感染的最有效手段，但近年来临床上抗菌药物的过度使用导致耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)的产生，并在全球范围内呈广泛流行的趋势。碳青碳青霉烯酶是碳青霉烯水解内酰胺酶，主要包括KPC丝氨酸β-内酰胺酶，NDM、IMP、VIM金属β-内酰胺酶与OXA48类金属β-内酰胺酶。这些碳青霉烯类耐药基因通常存在于质粒，使其能够在细菌间快速传播。因此，建立一种快速，特异性强，灵敏度高的诊断方法，对于耐碳青霉烯类细菌的防治具有重要意义。

目前，耐碳青霉烯类细菌的主要诊断方法有改良霍奇实验(MHT)，Carba NP试验(CNP)，碳青霉烯类灭活试验(CIM)，流式细胞术(FC)，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)与核酸扩增等方法。改良霍奇实验所用试剂价格便宜，操作简便，在2010年美国和临床实验室标准化协会(CLSI)推荐其为CRE表型确证实验，但其耗时长且难以解释某些结果，不能区分酶类型，2018年已从M100-S28文件中删除；Carba NP试验(CNP)快速，准确，但试验操作繁杂，需特殊试剂，不适合在常规实验室开展；碳青霉烯灭活试验(CIM)操作简单，价格低廉，试剂易获得，但所需时间较长，不能进行快速检测；流式细胞术(FC)具有可定量分析、简便、耗时短等优点，但其所需设备昂贵，未在常规实验室开展；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术是一种快速、低成本、高通量的CRE检测方法，但其只能检测产酶CRE，且质谱仪价格昂贵，方法尚未标准化；以核酸扩增为基础的实验技术，具有快速，灵敏，特异性强的特点，比如PCR、LAMP等。但因PCR技术对操作人员技能有较高要求，需要的热循环设备价格昂贵而难以推广，环介导等温扩增技术克服了上述缺点，具有反应快速，操作简单的优势，一台水浴锅等恒温设备即可操作，扩增结果可用肉眼进行判定，对员工简单培训即可完成操作，适合在基层医疗机构中应用。但PCR，LAMP等分子生物学检测法是针对CRE的碳青霉烯酶中的型别进行检测。如今的LAMP检测技术已日趋成熟，国内外关于LAMP检测OXA48家族基因也屡现不鲜，但检测方式不尽相同。如有学者使用荧光定量PCR仪进行LAMP反应，可以实时记录曲线，进行定性与半定量检测，但该仪器昂贵，需要专业人员进行仪器操作；有学者还使用羟基萘酚蓝作为LAMP的显色剂，反应大约1小时左右，但羟基萘酚蓝颜色变化不明显，不同的人肉眼观测，误差较大。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是要提供一种LAMP检测耐碳青霉烯酶阴沟肠杆菌OXA48家族基因的引物组合物及相应的试剂盒，该引物组合物的序列设计合理，特异性强，灵敏度高；含有该引物组合物的试剂盒特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉眼观察扩增结果；

本发明的另外一个目的，是提供一种LAMP检测耐碳青霉烯酶阴沟肠杆菌OXA48家族基因的方法，该方法简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增时间较短，节省时间，25-30分钟即可完成扩增，扩增结果通过肉眼进行观察。