[发明专利]基于纳米抗体的犬瘟热病毒抗原检测试纸条及其制备方法

说明书

本发明属于生物检测技术领域，公开了基于纳米抗体的犬瘟热病毒抗原检测试纸条及其制备方法，该基于纳米抗体的犬瘟热病毒抗原检测试纸条，包括外壳和配套使用的样品稀释液，外壳内装配有试纸条，试纸条包括PVC底板，PVC底板上黏贴有样品垫、金标垫、包被膜和吸水垫，金标垫为玻璃纤维素膜，包被有纯化的抗犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体与胶体金的偶联标记物；包被膜为硝酸纤维素膜，包被膜上涂设有一条包被有纯化抗犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的检测线和一条包被有羊抗鼠IgG抗体的质控线，本发明整体制造成本低廉、抗体与蛋白结合稳定、灵敏度较高、检测方便快速。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体的说，涉及基于纳米抗体的犬瘟热病毒抗原检测试纸条及其制备方法。

背景技术

犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，传染性强，死亡率达30%-80%，在世界范围内广泛流行；近年来，由于环境变化，动物栖息地人为干预，病毒的进化，该病在我国的发病率不断上升，其宿主范围也有不断扩大的趋势，对犬饲养业、经济动物养殖业及野生动物保护事业造成了严重危害，因此，对该病的防控和诊断尤为重要。

犬瘟热病毒的传统检测方法有血清学检测方法和病原学检测方法；其中，血清学检测方法主要包括：血凝试验、酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析等方法，但均存在灵敏度不高、特异性不强的问题；且宠物疾病抗体检测的需求相对于抗原偏少。

病原学检测方法主要包括：病毒分离法、分子生物学检测、酶联免疫吸附试验和胶体金免疫层析；病毒分离方法虽然在理论上可以检出一个感染性的病毒粒子，确诊犬瘟热病毒的感染，但也因分离病毒的操作繁琐、成本高及确诊缓慢等因素不适于临床使用。

分子生物学检测和酶联免疫吸附试验则由于需要使用配套的精密仪器、检测步骤繁琐、用时长、价格昂贵，对技术人员和环境要求高等原因，不适于在小型诊所和野外现场检测。

免疫层析法是采用犬瘟热病毒抗原免疫层析检测试纸条进行检测，因其操作简单、方便快捷，无需仪器和专业人员，结果判定只需3-10分钟、适于现场使用等优点，深受客户偏爱。

目前，已有的犬瘟热病毒抗原免疫层析检测试纸条均采用双抗夹心法，其中的双抗一般是用纯化的蛋白免疫小鼠，通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体，这种单克隆抗体存在以下不足：（1）体积相对较大，结合蛋白不稳定；（2）开发周期长，生产成本高，产量低；（3）难以大规模生产；（4）容易降解，保存成本高；（5）容易污染，维护成本高昂，在高温和强酸强碱的条件下会分解，须在低温下保存，否则就会在数周内完全失去活性。

另外，也有采用病毒颗粒制备的单克隆抗体，但由于病毒颗粒制备单克隆抗体时，非特异性抗原表位产生的非特异性抗体太多，给阳性克隆的筛选带来了很大困难，所以，从原料方面着手，对免疫层析检测试纸条进行工艺改进和突破具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的主要技术问题是提供一种结合蛋白稳定，检测灵敏度高，生产设制造成本低，抗体原料热稳定性好的基于纳米抗体的犬瘟热病毒抗原检测试纸条及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

基于纳米抗体的犬瘟热病毒抗原检测试纸条，包括外壳和配套使用的样品稀释液，外壳内装配有试纸条，试纸条包括PVC底板，PVC底板上黏贴有样品垫、金标垫、包被膜和吸水垫，金标垫为玻璃纤维素膜，包被有纯化的抗犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体与胶体金的偶联标记物；包被膜为硝酸纤维素膜，包被膜上涂设有一条包被有纯化抗犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的检测线和一条包被有羊抗鼠IgG抗体的质控线；

抗犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；抗犬瘟热病毒H蛋白纳米抗体的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

以下是本发明对上述技术方案的进一步优化：