[发明专利]一种降低或消除重组蛋白CEX酸性峰的方法

说明书

本发明针对含有GS类连接子的重组蛋白纯化后存在影响生物活性酸性峰的技术问题，根据酸性峰的产生受GS类连接子中丝氨酸残基上以木糖为核心的O‑糖基化修饰影响的机理，提供了一种除去重组蛋白酸性峰的方法，采用多模式阴离子交换层析，除去O‑木糖修饰酸性变异体，通过阳离子交换色谱鉴定重组蛋白酸性峰降低至30%以下。本发明所述方法尤其适用于重组双特异性抗体（例如抗NKG2A/PD‑L1双特异性抗体）亲和层析后的进一步纯化。

技术领域

本发明涉及药物纯化工艺研究领域，特别是涉及一种降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法。具体而言，本发明涉及一种降低或消除重组人源化抗NKG2A和PD-L1双特异性抗体（6MW3411双抗）中含O-木糖修饰的酸性变异体的纯化方法。

背景技术

近几年来，肿瘤免疫治疗取得了前所未有的成功，仍只有少数患者表现出持久的疗效。改善临床响应以及克服耐药机制是肿瘤免疫治疗领域正面临的挑战，而阻断其它抑制性免疫受体可能是一种可行的策略。

NKG2A（killer cell lectin like receptor C1）又名KLRC1或CD159A，是一类II型跨膜蛋白，属于NKG2/CD94自然杀伤细胞凝集素受体家族。NKG2A在胞外具有识别碳水化合物的结构域CRD(Carbohydrate-recognitiondomain，通常由115-130个氨基酸组成，含2-3个二硫键，有2-3个N连接的糖基化位点，其配体识别的过程往往是Ca2+依赖性的)。NKG2A主要在NK细胞、NKT细胞以及T细胞中表达；相对分子质量为43000，由233个氨基酸组成，其胞外区有135个氨基酸。NKG2A通过与其配体HLA-E的相互作用来抑制免疫细胞的激活。HLA-E广泛表达于头颈癌、肺癌、前列腺癌以及结直肠癌等多种肿瘤细胞表面，而免疫细胞释放的IFN-γ会进一步上调HLA-E的表达 （J Clin Invest. 2019; 129(5): 2094-2106）。与其它受体-配体（如PD-1/PD-L1）类似，NKG2A/HLA-E这对免疫检查点也是肿瘤免疫逃逸的重要信号通路，阻断NKG2A/HLA-E之间的相互作用成为了肿瘤免疫治疗领域一个非常有潜力的靶点。目前有多家公司（如Innate Pharma/Novo Nordisk/AstraZeneca 和 ChemPartner）开发了针对NKG2A的单克隆抗体，通过阻断NKG2A/HLA-E的相互作用来提高NK细胞以及T细胞的免疫活性来杀伤肿瘤细胞。

最新的研究发现，NKG2A与PD-1在头颈癌及黑色素瘤浸润性的CD8+ T细胞上共表达，同时阻断NKG2A/HLA-E及PD-1/PD-L1两条信号通路有很强的协同抗肿瘤作用（Cell.2018; 175: 1-13, Cell. 2018; 175: 1744-1755）。同时针对多种靶点进行治疗对提高肿瘤免疫治疗的响应率及降低免疫耐受有积极的作用。目前针对NKG2A的治疗性抗体对抗原的亲和力不足、结合NKG2A单靶点对肿瘤的治疗效果不佳，全球范围内尚没有针对NKG2A的上市药物。法国Paoli-Calmettes研究院正在推进一项人源化抗NKG2A单抗IPH2201与同种异体干细胞移植联用治疗血液恶性肿瘤的I期临床安全性实验（NCT02921685）。申请人已经通过构建轻重链突变抗体库进行亲和力提高和/或解离常数改善的突变抗体，将突变抗体的CDRs区构建人Fab重链基因表达载体和含人κ亚类轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中，将亲和力成熟抗体的重链载体和轻链载体交叉配对，筛选获得抗NKG2A的突变Fab抗体，连接人抗体Fc段。将抗PD-L1纳米抗体通过linker连接到Fc段的C端，获得对NKG2A和PD-L1具有双特异性的抗体。