[发明专利]一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法

权利要求书

1.一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1获取种子：通过人工异花授粉获得多胚柑橘品种的种子；

S2叶片鉴定：取萌芽后的多胚柑橘的叶片鉴定有无病毒；

S3移栽高接：取多胚柑橘无病毒幼苗的茎尖高接到基砧上；

S4获取母本：多胚柑橘完全成熟、并鉴定珠心胚后代与母本株性状一致后，获得母本脱毒株。

2.如权利要求1所述的一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法，其特征在于，所述步骤S2中，通过实时荧光定量PCR检测，其检测病毒包括柑橘黄龙病、柑橘黄脉病毒、柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘碎叶病。

3.如权利要求2所述的一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法，其特征在于：柑橘黄龙病菌荧光定量PCR检测反应体系包括2×Premix Ex Taq、250nM的上下游引物、150nM探针、待测样品DNA和无菌双蒸水；反应在Bio-rad CFX96TMPCR仪上进行，扩增程序如下为95℃预变性2min，95℃10s，58℃30s，40个循环，柑橘黄龙病用荧光定量PCR检测的引物为HLBas:5-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3′、HLBr:5′-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3′、和探针HLBP:5′-AGACGGGTGAGTAACGCG-3′(探针：5′FAM标记，3′BHQ-1标记)；用于柑橘黄脉病毒常规PCR检测的引物为TGB-1f:ATGGACTTACCTGAGCTCCTG,TGB-1R:TCAGGAGGAGGTTGTAGAGGCA；用于柑橘衰退病毒常规PCR检测的引物为CTV-CP1:ATGGACGACGAAACAAAG,CTV-CP3：TCAACGTGTGTTGAATTT；用于柑橘萎缩病毒常规PCR检测的引物为SDV-CM:CAGAAATCAAGAAAAACAC，SDV-CP:GGGAAAGCTGCTTATTTAGG；用于柑橘碎叶病毒常规PCR检测的引物为CTLV-Fn:CCCTCTCAGCTAGAATTGAA,CTLV-Rn:AGAGTGGACAAACTCTAGAC。

4.如权利要求1所述的一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法，其特征在于，所述步骤S1中，选取花粉萌芽能力强的品种作为雄株，以需要脱毒的柑橘品种作为雌株，采摘花粉已萌发的雄株雄蕊授粉至去雄且尚未露柱授精的雌株雌蕊上，授粉后套袋，果实成熟后剥种获得种子。

5.如权利要求1所述的一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法，其特征在于，所述步骤S1中，多胚有核柑橘品种通过采收成熟果实剥种获得种子，多胚无核柑橘品种通过异花授粉获得种子。

6.如权利要求1所述的一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法，其特征在于，所述步骤S1与所述步骤S2之间还包括步骤：

S5消毒播种：对多胚柑橘的种子进行热处理后采用清洁基质进行播种；

其中，将获得的种子清洗干净后用38～42度的温水预热13～17分钟，再放入预先调好的51～55度温水中进行热处理，经48～52分钟后取出种子，培养土基质采用无菌泥炭土和蛭石，使恒温恒湿培养箱温度控制在28～30度，相对湿度控制在85％-95％，光照量采用全光照量并控制在1800～2200lx。

7.如权利要求1所述的一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法，其特征在于，所述步骤S3与步骤S4之间还包括：

S6形成母枝：将高接后的嫩芽留单枝连续放梢，待单杆生长至2米以上的高度，斜向拉直单杆主枝，形成结果母枝。

8.如权利要求1所述的一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法，其特征在于：所述步骤S3与步骤S4之间还包括：

S7防治落果：开花后使用保果药物，以防治自然生理落果。

9.如权利要求1所述的一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法，其特征在于：所述步骤S3中，将无病毒幼苗茎尖高接到3年生以上且干径达到3cm以上的基砧上。

10.如权利要求1所述的一种多胚柑橘品种快速脱除病毒病的方法，其特征在于：所述步骤S3中，选用早花、易花、生长迅速的砧木品种大苗作为基砧。