[发明专利]一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法

权利要求书

1.一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）植株预处理：选取橡胶树无菌试管苗，去除顶芽及子叶以下的根部，切成1-2cm的茎段，每个茎段均带有一个或多个腋芽；

（2）腋芽诱导：将步骤（1）得到的带有腋芽的茎段，接种到腋芽诱导培养基中，诱导腋芽萌发至1-2mm；

（3）外植体的选取：轻轻分离步骤（2）萌发出腋芽的茎段，剥离出新萌发的腋芽嫩叶作为外植体；

（4）愈伤组织诱导：将步骤（3）剥离得到的腋芽嫩叶接种于愈伤组织诱导培养基中，进行培养，得到黄色且结构较为疏松的颗粒状组织；

（5）继代培养：将步骤（4）得到的疏松的颗粒状组织接种于继代培养基中，进行培养，得到淡黄色且结构较为致密的颗粒状组织；

（6）体胚诱导：将步骤（5）得到的致密的颗粒状组织接种于胚状体诱导培养中，进行培养，得到胚状体；

（7）植株诱导：将步骤（6）得到的成熟胚状体接种于植株诱导培养基中，光照培养，即可得到橡胶树再生植株；

其中，所述步骤（2）中，诱导腋芽萌发的条件为：将切好的1-2cm带有腋芽的茎段接种到腋芽诱导培养基中，在24-28℃条件下，暗培养3-20d；

所述腋芽诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，附加6-苄基氨基嘌呤1-2mg/L，蔗糖20-40g/L，Phytagel2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2；

所述步骤（4）中，愈伤组织诱导条件为：在 24-28℃条件下，暗培养60-70d；所述愈伤组织培养基是以MS培养基为基础培养基，附加毒莠定12-24 mg/L，6-苄基氨基嘌呤0.5-2mg/L，蔗糖50-70g/L，椰子水5%V/V,Phytagel 2.2g/L；补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2；

所述步骤（5）中，所述继代培养基是以MS培养基为基础培养基，附加蔗糖20-30g/L，活性炭1.5-2g/L，Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2；

所述的胚状体诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，附加6-苄基氨基嘌呤0.5-2mg/L，细胞激动素1-3mg/L，2，4-D 0.02-0.06mg/L，赤霉素0.3-0.8mg/L，肌醇0.1g/L，活性碳0.1% W/V，蔗糖50-70g/L，椰子水5% V/V,Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2；

所述步骤（7）中，所述的植株诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，附加细胞激动素0.2-0.5mg/L，赤霉素2-3mg/L，吲哚乙酸0.1-0.3mg/L，肌醇0.1g/L，活性碳0.1% W/V，蔗糖30-50g/L，椰子水5% V/V,Phytagel 2.2g/L，补充蒸馏水至1L；调培养基的pH至5.8-6.2。

2.如权利要求1所述的橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，选取的橡胶树无菌试管苗其物候期为稳定期的植株。

3.如权利要求1所述的橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，分离新萌发的腋芽嫩叶在无菌环境中，将萌发后腋芽置于体视显微镜下剥离出嫩叶。

4. 如权利要求1所述的橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，继代培养条件为：在 24-28℃条件下，暗培养50-60d。

5. 如权利要求1所述的橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤（6）中，体胚诱导条件为：在 24-28℃条件下，培养50-60d。

6. 如权利要求1所述的橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，其特征在于，所述步骤（7）中，植株诱导条件为：在 24-28℃，光源采用光源组合盒，所述光源组合盒由白光和红光的LED灯珠按7：1数量共组成84个LED灯珠，总光照强度为3500-3800 Lux，光照周期为12/12h（光照/黑暗）的光照条件下培养30-40d。