[发明专利]一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法

说明书

本发明提供了一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，涉及植物组织和细胞工程技术领域。具体包括以下步骤：选取橡胶树无菌试管苗，去除顶芽及子叶以下的根部，切成1‑2cm的茎段，每个茎段均带有一个或多个腋芽；将带有腋芽的茎段，接种到腋芽诱导培养基中，诱导腋芽萌发；分离萌发出腋芽的茎段，剥离出新萌发的腋芽嫩叶作为外植体；将外植体进行愈伤组织诱导、继代培养、体胚诱导和植株诱导，即可得到橡胶树再生植株。本发明的方法不受采样时间和季节的限制，取材方便，材料丰富，可以完整保持母本植株的遗传稳定性，组培过程易于控制，尤其适合大规模批量化生产制备。

技术领域

本发明属于植物组织和细胞工程技术领域，具体涉及一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法。

背景技术

橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)属大戟科橡胶树属，是多年生的异花授粉乔木。其所产的天然橡胶是重要的工业原料和战略物资，在国民经济中占有举足轻重的地位。而通过体细胞胚发生途径来获得再生植株是植物组培苗工厂化生产和遗传转化的重要方法。现有技术中，橡胶树经体细胞胚发生途径获得再生植株主要采用1.花药培养、2.内珠被培养和3.次生体胚循环增殖。

1.橡胶树花药培养技术是以处于单核期的橡胶树雄花为外植体，剥离雄蕊，接种于诱导愈伤培养基中诱导愈伤组织，再将愈伤组织接种于诱导体胚培养基诱导体胚发生，最后将成熟胚状体接种于植株再生培养基中诱导出完整小植株。2.橡胶树内珠被培养技术是以橡胶树授粉后45-75d天的幼果中的内珠被为外植体，诱导愈伤组织，再经愈伤组织分化体胚，最后由成熟的胚状体分化成植株。3.次生体胚循环增殖是以花药或内珠被诱导的初生胚为外植体，将胚状体切成2-3mm小块，诱导次生胚，此过程循环，直至获得足够量胚状体，最后诱导植株再生。

以上所说的再生技术体系均存在以下缺陷：①花药、内珠被再生体系：外植体的来源易受到季节和时间的制约，无法做到全年培养。橡胶树每年有三个花期，分别为春花、夏花和秋花，每次进行花药培养的时间有限。一般来说，橡胶树的春花的自然授粉的比率比夏花、秋花要高，因此内珠被的取材时间一般为春花自然授粉后45-75d也就是在中国海南每年的5月中旬至6月中旬为采样进行内珠被培养的最佳时期，这种较短的取材时间严重制约了内珠被的培养。(孙爱花等，橡胶树花药的培养，植物生理学通讯，2006，42(4)：785-789；黄天带等，橡胶树内珠被研究进展，生命科学研究，2011，15(2)：176-183)。②次生体胚循环增殖体系：次生体胚在室内扩繁逐渐累积激素，可能造成变异。

这些缺点制约了橡胶树遗传转化体系的建立，因此必须在橡胶树中建立一种不受采样时间限制的体细胞胚胎发生技术体系，(1)突破橡胶树组织培养外植体来源的限制，可为将来新品种、转基因或基因编辑植株的早期扩繁提供技术基础；(2)为橡胶树自根幼态无性系规模化繁育及转基因育种提供新的组培体系。大田、苗圃茎段腋芽嫩叶是理想的外植体来源，四季均可获得，然而目前并无该外植体的再生体系报道，本发明为建立室外来源的腋芽嫩叶再生体系奠定技术基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，以切除顶芽及子叶以下根部的，橡胶树无菌试管苗茎段诱导出的，新生腋芽嫩叶作为外植体，通过体细胞发生途径获得橡胶树再生植株。本发明的方法不受采样时间和季节的限制，取材方便，材料丰富，可以完整保持母本植株的遗传稳定性。

为实现上述目的，本发明提供一种采用橡胶树试管苗嫩叶诱导体胚发生和植株再生的方法，具体包括以下步骤：

(1)植株预处理：选取橡胶树无菌试管苗，去除顶芽及子叶以下的根部，切成1-2cm的茎段，每个茎段均带有一个或多个腋芽；

(2)腋芽诱导：将步骤(1)得到的带有腋芽的茎段，接种到腋芽诱导培养基中，诱导腋芽萌发至1-2mm；

(3)外植体的选取：轻轻分离步骤(2)萌发出腋芽的茎段，剥离出新萌发的腋芽嫩叶作为外植体；