[发明专利]一种重组海藻糖酶的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种重组海藻糖酶的制备方法，属于生物工程技术领域。本发明将来源于大肠杆菌BL21的海藻糖酶编码基因在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中表达，获得重组海藻糖酶。本发明利用安全菌株谷氨酸棒杆菌表达海藻糖酶，表达效果好、菌株培养条件简单、培养时间短，制得的重组海藻糖酶安全性好，可利用范围广，该重组海藻糖酶能够专一性地水解海藻糖产生葡萄糖，而且重组海藻糖酶在低温和冷冻保藏条件下稳定性较好，能够长时间保存。本发明制得的含有重组海藻糖酶的酶液可用于快速检测样品中海藻糖的含量，样品处理简单，用时少，设备要求低，检测准确度高。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组海藻糖酶及其在海藻糖检测中的应用。

背景技术

海藻糖是由两分子葡萄糖以α,α-1,1糖苷键连接的二糖，具有无还原性、化学性质稳定等特点。海藻糖在自然界中分布广泛，细菌、真菌、植物和无脊椎动物如昆虫、线虫、虾等体内均含有海藻糖。研究表明，海藻糖能够保护细胞膜、蛋白质等生物大分子，帮助生物耐受高温、冷冻、高渗透压等恶劣环境，是生物体中的一种应激合成代谢物。海藻糖酶可以将海藻糖分解成两分子葡萄糖，广泛存在于动物、植物和微生物体内。近年来，海藻糖酶在发酵工业上的应用逐渐受到重视。玉米乙醇工业中，海藻糖是发酵残糖的主要成分之一，诺维信公司在2017年2月22日宣布推出具有海藻糖酶活性的葡糖淀粉酶套件，可减少70％的发酵残糖，提高乙醇产率；谷氨酸发酵过程中，发酵后期菌株会合成并积累一定量的海藻糖，导致残糖量的增加，并且影响谷氨酸的提取，韩隽等通过在谷氨酸发酵后期加入海藻糖酶提高了谷氨酸产量和糖酸转化率。

生产海藻糖酶的关键是获得产酶微生物，可从自然界中筛选获得产海藻糖酶的微生物，也可通过构建基因工程菌株获得产海藻糖酶的重组菌株。江南大学董琦等从海藻糖驯化的土壤样品中筛选获得了产海藻糖酶的大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)C2；江南大学于林港等将Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655的海藻糖酶编码基因在E.coliBL21中进行重组表达；广东溢多利生物科技股份有限公司黄江等将嗜热真菌Thermothelomyces的海藻糖酶编码基因进行密码子优化并在毕赤酵母中进行表达；E.coliBL21中同样存在海藻糖酶编码基因trl，该基因与已报道的E.coli str.K-12substr.MG1655的海藻糖酶编码基因相似度为98.42％，序列中存在26个差异核苷酸，而且编码蛋白中存在一个氨基酸残基差异，目前没有E.coli BL21中海藻糖酶的相关研究和报道。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种安全菌株，其蛋白水解酶活性低从而有利于重组蛋白的稳定性；同时其糖水解酶背景少，如与大肠杆菌相比，其胞内乳糖水解酶活性很低。利用谷氨酸棒杆菌表达海藻糖酶可以扩展海藻糖酶的应用范围，如食品添加剂等安全性要求较高的产品的发酵生产。目前，没有利用谷氨酸棒杆菌表达海藻糖酶的相关报道。

另一方面，在海藻糖生产过程中，需要对海藻糖浓度进行不间断检测，因此简单快速地海藻糖含量分析方法在生产过程中非常重要。目前，海藻糖检测主要通过HPLC进行，如国标GB/T 23529-2009推荐方法，但利用HPLC分析海藻糖需要用到有一定毒性的乙腈试剂，而且样品处理要求较高，并受特定设备条件限制。目前，海藻糖生产主要是酶催化法。如利用海藻糖合酶催化麦芽糖转化合成海藻糖，该反应体系中主要存在海藻糖、麦芽糖和葡萄糖。利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶共同作用催化麦芽寡糖合成海藻糖，反应体系中主要存在海藻糖、葡萄糖和麦芽寡糖。因此，利用海藻糖酶将海藻糖水解成容易检测的葡萄糖具有简单快速地分析海藻糖的应用潜力，而催化活性高、海藻糖水解专一性好、容易制备和保存的海藻糖酶是酶法分析海藻糖的关键。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种重组海藻糖酶的制备方法。

技术方案