[发明专利]一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒

权利要求书

1.一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，其特征在于：包含裂解结合液、纳米磁珠、洗涤液、洗脱液；

所述裂解结合液的pH值为5.7～7.9，包括1.2～4.8M的琥珀酸二异辛酯磺酸钠、1.5～2.6mM的异硫氰酸胍、2.3～3.8mM的盐酸胍、1.3～3.4mM的SDS、1%～3.6%的 MES和10%～20%的PEG；

所述纳米磁珠为以聚苯乙烯为核心，纳米四氧化三铁为夹心，以二氧化硅或纤维素为包覆，并用PEG包裹，然后进行羧基化修饰的纳米磁性颗粒；所述纳米磁珠为多层夹心结构，直径为400～2000nm，浓度为30～80mg/ml；

所述洗涤液包括80～160mM十六烷基三甲基溴化铵、pH值为7.5～8.5的20～38mMTris-Hcl、5%～9%的ASEA和10～50mM的FMES；

所述洗脱液的pH不低于8.0，包括EDTA和Tris-Hcl。

2.根据权利要求1所述的一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，其特征在于：所述裂解结合液中选用的PEG分子量大于2000。

3.根据权利要求1所述的一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，其特征在于：所述纳米磁珠通过以下方法进行制备：a:选取粒径在400～700nm的聚苯乙烯微球100g，分散在1L的无水乙醇溶液中；b:加入按物质的量比为3:2配置的4mol/L的 Fe³⁺与Fe²⁺的混合盐溶液400ml，通入惰性气体除氧30min，调整体系温度为60～65℃，加入氨水至体系PH值为10，反应2h，加入50ml按体积3:2预混的油酸与月桂酸混合物，继续反应30min，然后迅速冷却至30℃，磁分离后，用50%乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，然后分散在800ml无水乙醇中；c:加入正硅酸四乙酯和氨水200ml或羧甲基纤维素与氨水260ml，反应1h，然后磁分离并用30%乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，最后分散在800ml30%乙醇溶液中；d:加入20%的PEG6000溶液200ml，加入氨水至体系PH值为10，80℃孵育2h，加入柠檬酸溶液100ml，继续反应30min，然后磁分离并用30%乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，最后分散在2L含有PEG和吐温的磁珠基液中。

4.根据权利要求1或3所述的一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，其特征在于：所述纳米磁珠的ZETA电位不大于-30。

5.根据权利要求4所述的一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，其特征在于：所述纳米磁珠的基液包含15%～30%PEG和1%～10%吐温20；所述纳米磁珠基液中PEG分子量不小于4000；所述纳米磁珠基液的表面张力不小于70达因/厘米。

6.利用权利要求1-5任意一项所述的提取试剂盒进行用于产前诊断的cfDNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤S1：取500～1200ul新鲜血浆样本于5ml或10ml离心管中，使用无菌移液器加入900～2500ul裂解结合液，50～90℃温浴震荡混匀10～30min；

步骤S2：加入10～50ul纳米磁珠，震荡混匀5～15min；

步骤S3：将经步骤S2处理的离心管置于磁力架上，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

步骤S4：使用无菌移液器向经步骤S3处理的离心管中加入500～800ul洗涤液，震荡混匀2min，置于磁力架上，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；

步骤S5：使用无菌移液器向经步骤S4处理的离心管中加入30～50ul洗脱液，65℃温浴震荡混匀3～5min，然后置于磁力架上，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸取上清溶液进行cfDNA检测。