[发明专利]一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，属于生物工程技术领域，所述试剂盒主要包括裂解结合液、纳米磁珠、洗涤液；本发明试剂盒采用多层夹心的羧基修饰PEG纳米磁珠，可无需洗脱而实现带磁珠扩增。特殊的裂解结合液与洗涤液成份，可针对性地获得cfDNA，而无需单独去除基因组DNA。该试剂盒无需使用乙醇、异丙醇等成份。该试剂盒可手工操作，亦可在市面现有核酸自动提取仪上进行自动化操作，而无需定制特殊耗材，具有操作步骤简单、cfDNA得率高、敏感性好、运输方便的特点。尤其是利用本发明试剂盒及试剂盒提供的操作方法，可简单快速得到能够直接用于产前诊断的cfDNA样本，提高产前诊断的效率和灵敏性。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒。

背景技术

血液中游离的DNA简称cfDNA（circulating free DNA），是指循环血液中的核酸类物质，包括循环血液中细胞内的核酸，游离的内源性脱氧核糖核酸和外源性DNA与RNA。血液中cfDNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要潜在价值。在特定的生理条件或疾病过程中，有相当一部分cfDNA会与在健康的时候不同，基于这一结果，近年来cfDNA已被用于无创性诊断。在孕妇中，约有10%-15%的cfDNA来自于胎盘滋养层，现在cfDNA多用于在高危孕妇中筛查胎儿的遗传缺陷，这就是是当前火热的无创唐氏筛查的基础！在肿瘤病人中，通过cfDNA的量化突变来检测肿瘤已被越来越多的人认可。而在移植方面，移植排斥反应也与供体移植器官中的cfDNA水平相关。

cfDNA是人体细胞排放到血液里的DNA片段，这些DNA的量很少，片段也很短，长度在170bp上下。现有技术中对cfDNA的提取存在以下难点和缺陷：由于cfDNA含量很低，提取难度较大，提取效率低，在产前诊断中导致未检出率较高，这限制了cfDNA作为一种常规检测手段的应用和发展；采用常规传统的提取方法提取得到的DNA为全基因组DNA，包含人类基因组中所有的DNA片段，在后续检测中会产生较大且复杂的背景噪音；传统的提取方法，提取步骤多、耗时长，并需要用到多种易燃的化学试剂，如乙醇、异丙醇等。

发明内容

为提高cfDNA的提取效率，本发明的目的一在于提供一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒。目的二在于提供利用所述提取试剂盒进行用于产前诊断的cfDNA的提取方法；目的三在于所述提取试剂盒在制备产前诊断药物中的应用。

所述试剂盒具有操作步骤简单、cfDNA得率高、敏感性好、运输方便的特点。利用本发明试剂盒及试剂盒提供的操作方法，可简单快速完成cfDNA检测的样本预处理工作。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案如下：

一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，包含裂解结合液、纳米磁珠、洗涤液、洗脱液；

所述裂解结合液的pH值为5.7～7.9，包括1.2～4.8M的琥珀酸二异辛酯磺酸钠、1.5～2.6mM的异硫氰酸胍、2.3～3.8mM的盐酸胍、1.3～3.4mM的SDS、1%～3.6%的 MES和10%～20%的PEG；

所述纳米磁珠为以聚苯乙烯为核心，纳米四氧化三铁为夹心，以二氧化硅或纤维素为包覆，并用PEG包裹，然后进行羧基化修饰的纳米磁性颗粒；所述纳米磁珠为多层夹心结构，直径为400～2000nm，浓度为30～80mg/ml；

所述洗涤液包括80～160mM十六烷基三甲基溴化铵、pH值为7.5～8.5的20～38mMTris-Hcl、5%～9%的ASEA和10～50mM的FMES；

所述洗脱液的pH不低于8.0，包括EDTA和Tris-Hcl。

作为对上述提取试剂盒的进一步优化，所述裂解结合液中选用的PEG分子量大于2000。