[发明专利]一株杂色曲霉ZLH-1、蛋白酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一株杂色曲霉ZLH‑1、杂色曲霉所产的蛋白酶及其制备方法和用途。本发明使用的菌株分离于中国南海海域的海绵中，分类命名为杂色曲霉(Aspergillus versicolor)，于2021年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.23230。杂色曲霉ZLH‑1经发酵、蛋白分离纯化后得到单一的蛋白条带，分子量为37.28kDa。该制备方法步骤简单、高效。本发明所述蛋白酶具有溶纤效果，可以高效溶解血栓，迅速恢复栓塞组织的血供，将成为血管栓塞性疾病治疗的潜在药物。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及一株海洋来源的杂色曲霉ZLH-1、蛋白酶及其制备方法和应用。

背景技术

根据2018年《中国心血管病报告》，中国心血管疾病（cardiovascular diseases，CVDs）患病人数的逐年上升，疾病死亡人数占因病死亡总人数的40.7％，高于肿瘤及其他疾病，占居民疾病死亡构成的 40% 以上。血液的非正常凝血造成血管阻塞形成的血栓性疾病是心血管疾病常见的一种类型，这类疾病因其具有高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率等的特点使大部分幸存者遗留不同程度的功能障碍，给患者、家庭乃至社会带来沉重的负担。寻求血栓治疗药物在临床治疗中具有重要的医学价值，其中在已形成的血栓性疾病中，能溶纤的蛋白酶具有巨大的应用前景。

近年来，临床上使用的一系列溶纤蛋白酶制剂多数是由陆栖原核微生物产生的，对于海洋源真核微生物的溶栓研究知之甚少。真菌作为真核微生物，具有完整的细胞器，而且海洋微生物因长期生活在海洋环境中，能够产生许多结构和功能与陆栖微生物不同的蛋白质类代谢物，是挖掘重要微生物代谢资源的宝库。

发明内容

本发明以海洋真菌作为研究目标，从中国南海海域的海绵中分离到一株产活性蛋白酶的曲霉菌株ZLH-1，经鉴定为杂色曲霉( Aspergillus versicolor)，该曲霉菌可以产生一种高效溶解纤维蛋白的蛋白酶，其制备方法简便、快速，所产纤溶酶组分单一，活性强，并通过一系列的试验证明该蛋白酶能够高效溶栓，为治疗心血管疾病，尤其是血栓类疾病提供了有效的溶栓药物。

本发明提供了一株杂色曲霉ZLH-1，其特征在于，所述杂色曲霉分类命名为杂色曲霉  Aspergillus versicolor，于2021年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.23230。

进一步的，本发明所述的杂色曲霉在PDA琼脂培养基上正面菌体呈絮状，菌落不平，中央部分隆起；菌体颜色随生长时间变化，初为白色，后呈不同程度的黄绿色，边缘始终为白色。该杂色曲霉产生可溶性色素，扩散于基质中，初始为黄色，随着时间的增长，转变为红色。

本发明提供了一种含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白酶。

进一步的，所述蛋白酶为M35家族的氘解素金属蛋白酶。

进一步的，所述M35家族的氘解素金属蛋白酶为纤溶酶。

进一步的，所述纤溶酶的分子量为37.28kDa。

本发明提供的蛋白酶是由杂色曲菌ZLH-1发酵而成的。

进一步的，所述纤溶酶的制备方法如下：

利用PDA固体培养基活化杂色曲霉ZLH-1，后将其接种至种子培养基中，获得种子液；

将上述种子液按2%的质量比接种至麦芽汁液体培养基中发酵，获得发酵液，发酵上清液加入固体硫酸铵至饱和度90%，分离沉淀，获得粗酶；

将上述粗酶经溶解、除盐和阴离子交换柱分离后获得纤溶酶。