[发明专利]基于亚铁离子-过氧化氢-罗丹明体系荧光猝灭法测定CAT活度的方法

说明书

本发明公开了基于亚铁离子‑过氧化氢‑罗丹明体系荧光猝灭法测定CAT活度的方法，该方法基于H₂O₂‑RhB‑Fe²⁺荧光猝灭体系实现过氧化氢酶(CAT)活度的测定，荧光物质罗丹明B于585 nm处有特征荧光峰，Fenton试剂作用致其荧光猝灭，CAT实现H₂O₂的分解，基于CAT加入前后荧光变化△F确定CAT活度，其中，△F=F‑F₀)，△F=‑3.466+1472E(U/mL)，r=0.9954。本发明的方法具有良好的抗干扰能力、重现性和准确性，对CAT活度的线性检测范围为0～0.056 U/mL，最低检出量可达到2.6×10^‑5U/mL，明显优于显色和褪色光度法。

技术领域

本发明涉及CAT活度检测领域，具体涉及一种基于亚铁离子-过氧化氢-罗丹明体系荧光猝灭法测定CAT活度的方法。

背景技术

过氧化氢酶(CAT)广泛存在于生物组织细胞中，适时分解糖代谢中间产物H₂O₂，在抗衰老、防病变等方面发挥重要生理作用。自1811年首次被发现CAT以来，关于其活性测定方法的研究从未停止，相继出现了滴定法、紫外分光度法、显色光度法。目前，研究的热点主要集中于催化光度法。

荧光光度法集稳定性、高灵敏性、低成本等于一体，罗丹明B(Rhodamine B，RhB)结构中的苯环之间有“氧桥”相连，具有刚性平面结构，能够吸收辐射光的能量而产生荧光，当其醌式结构遭到破坏，分子失去平面刚性结构而发生荧光猝灭；荧光探针罗丹明B在微量分析领域得到广泛应用，碘-罗丹明B缔合物荧光探针用于测定鱼肝提取液中CAT活度，有效避免共存还原性物质干扰，实用效果显著。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于亚铁离子-过氧化氢-罗丹明体系荧光猝灭法测定CAT活度的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

基于亚铁离子-过氧化氢-罗丹明体系荧光猝灭法测定CAT活度的方法，该方法基于H₂O₂-RhB-Fe²⁺荧光猝灭体系实现过氧化氢酶(CAT)活度的测定，荧光物质罗丹明B于585nm处有特征荧光峰，Fenton试剂(H₂O₂/Fe²⁺)作用致其荧光猝灭，CAT实现H₂O₂的分解，基于CAT加入前后荧光变化△F确定CAT活度，具体的，包括如下步骤：

在50mL的容量瓶中加入25~100 μL血清和2.80mL H₂O₂，30 ^oC水浴反应20 min，然后依次加入罗丹明B 4.00 mL 、缓冲溶液 2.50 mL 和Fe²⁺ 0.40 mL ，室温反应15 min后定容，蒸馏水作参比，在585 nm发射波长处测荧光强度F；

同步测定酶空白体系F₀，测定时，在50mL的容量瓶中加入25~100 μL血清，依次加入罗丹明B 4.00 mL 、缓冲溶液 2.50 mL 和Fe²⁺ 0.40 mL，振荡0.5min使酶失活后，加入2.80mL H₂O₂，室温反应15min后定容，蒸馏水作参比，在585 nm发射波长处测荧光强度F₀；