[发明专利]一种快速、准确测定生物样本中48种游离脂肪酸的方法

权利要求书

1.一种气相色谱-质谱联用准确定性、定量分析生物样本中48种游离脂肪酸的方法，包括如下步骤：

(1)样本提取；

(2)向提取液中加入同位素正十七烷酸内标物，并加入三氟化硼甲醇溶液进行衍生化反应；

(3)衍生后溶液经过萃取，利用GC-MS/MS在25min内对生物样本中48种游离脂肪酸准确定性、定量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)具体为：向血清样本中加入提取液，所述的提取液由甲醇：MEBE:36％磷酸按体积比为3:4:1组成；振荡3min，上清液吹干，加入200μL15％三氟化硼甲醇溶液，振荡2min，60℃烘箱下保持30min。

3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(3)的萃取是指：将步骤(1)获得的溶液冷却至室温，加入500μL正己烷，200μL饱和氯化钠溶液，振荡3min，4℃下12000r/min离心2min，取200μL上层溶液，至棕色进样瓶中玻璃内衬管内，用于GC-MS/MS分析。

4.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(3)的GS-MS/MS分析中，气相色谱仪条件主要包括：1)色谱柱：DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，Agilent公司)；2)载气：高纯氦(纯度99.999％)；3)升温程序：40℃(保持2min)，以30℃/min升至200℃，保持1min，以10℃/min升至240℃，保持1min，以5℃/min升至285℃保持3min；4)流量：1.0mL/min；进样口温度：230℃；进样量：1.0μL。

5.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤(3)中的GS-MS/MS分析中，质谱条件如下：电子轰击离子源温度230℃；电离电压：70Ev；传输线温度：240℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：4.0min；扫描模式：SIM。

6.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤(3)中的GS-MS/MS分析还包括数据处理的步骤；优选的，所述的数据处理为：利用软件Qualitative Navigator处理质谱数据；更优选的，根据每种物质保留时间和离子对信息，对每种游离脂肪酸在样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确；更优选的，每个色谱峰的峰面积(Peak Area)代表对应游离脂肪酸的相对含量，最终得到样本中游离脂肪酸的定性和定量分析结果。

7.根据权利要求1所述的方法，所述的数据处理包括：(1)样本质控分析：通过对固定浓度的混标质谱检测分析的总离子流图进行重叠展示分析，以判断游离脂肪酸提取和检测的重复性；(2)标准曲线绘制：配制不同浓度的游离脂肪酸标准品溶液，获取48种游离脂肪酸各个浓度标准品的对应定量信号质谱峰强度数据；以标准品浓度(μg/mL)为横坐标，质谱峰的峰面积(Peak Area)为纵坐标，绘制48种游离脂肪酸标准曲线；(3)绝对定量：将检测到的所有样本的所有游离脂肪酸的积分峰面积分别代入标准曲线线性方程进行计算，将计算结果进一步代入含量计算公式，计算后得到实际样本中每种游离脂肪酸的绝对含量。

8.权利要求1-7任一项所述的方法在血清样本中游离氨基酸含量的检测的应用；优选的，所述的应用为非诊断方法的应用；更优选的，所述的检测样本为人体样本；最优选的，所述的样本为人体血清样本。