[发明专利]一种快速、准确测定生物样本中48种游离脂肪酸的方法

说明书

本发明利用GC‑MS/MS的方法，通过样本分离萃取，能够在25分钟；检测人体血清中游离的48种脂肪酸；多反应检测模式建库，排除假阳性干扰，更为准确，且灵敏度高。

技术领域

本申请涉及样本中标志物的检测，具体涉及48种游离脂肪酸的检测，属于生物检测领域。

背景技术

脂肪酸(Fatty acid，FA)由C、H、O三种元素组成，是一端含有一个羧基的脂肪族碳氢链。脂肪酸可分成两类：一类是分子内不带碳碳双键的饱和脂肪酸，如硬脂酸、软脂酸等；另一类是分子内带有一个或几个碳碳双键的不饱和脂肪酸，最常见的有油酸，油酸的碳链中只有一个碳碳双键，所以又叫单不饱和脂肪酸。一般脂肪酸化合物的碳链都较短，其长度一般在18-36个碳原子，最少的就是12个碳原子，如月桂酸。不管饱和的或不饱和的，生物体内脂肪酸的碳原子数大多是偶数，极少含有奇数碳原子，尤其是在高等动植物体内主要存在12碳以上的高级脂肪酸，一般在14-24个碳，以16和18碳脂肪酸最为常见。

游离脂肪酸又称为非酯化脂肪酸(nonestesterified fatty acid，NEFA)。存在于人体内的脂质，大致可以分为胆固醇、中性脂肪(三酸甘油脂)、磷脂质等3种。游离脂肪酸是中性脂肪分解成的物质之一。当肌肉活动所需能源——肝糖耗尽时，脂肪组织会分解中性脂肪成为游离脂肪酸来充当能源使用。所以，游离脂肪酸可说是进行持久活动所需的物质。研究表明，胰岛素、脂联素、泛酸、促酰化蛋白等会促使血液中NEFA水平的降低，而肿瘤坏死因子-α、儿茶酚胺类激素、白细胞介素-6、瘦素等会导致NEFA水平的增加。另外，血液中NEFA水平的升高与心血管疾病、肝脏疾病、糖尿病等相关疾病关系密切，因此，临床上已经将测定血液中NEFA的水平作为评价和诊断上述疾病的辅助性指标。

气相色谱法–质谱法联用(英语：Gas chromatography–mass spectrometry，简称气质联用，英文缩写GC-MS)是一种结合气相色谱法和质谱法的特性，在试样中鉴别不同物质的分析的方法。GC-MS的使用包括药物检测(主要用于监督药物的滥用)、火灾调查、环境分析、爆炸调查和未知样品的测定。GC-MS也用于为保障机场安全测定行李和人体中的物质。另外，GC-MS还可以用于识别物质中以前认为在未被识别前就已经蜕变了的痕量元素。

GC-MS已经被广泛地誉为司法学物质鉴定的金标方法，因为它被用于进行“专一性测试”。所谓“专一性测试”就是能十分肯定地在一个给定的试样中识别出某个物质的实际存在。而非专一性测试则只能指出试样中有哪类物质存在。尽管非专一性测试能够用统计的方法提示该物质具体是那种物质，但存在识别上的正偏差。刘佩珊等利用GC-MS的方法检测血清中的游离脂肪酸，可以检测31种(刘佩珊等，气相色谱-质谱法测定血浆中31种游离脂肪酸含量，分析测试学报，2020年第8期)。本发明将克服现有技术中的缺陷，以更短的时间检测更多种类的游离脂肪酸。

发明内容

本发明公开了一种气相色谱-质谱联用仪25min内准确定性、定量分析生物样本中48种游离脂肪酸的方法，包括如下步骤：

(1)样本提取；

(2)向提取液中加入同位素正十七烷酸内标物，并加入三氟化硼甲醇溶液进行衍生化反应；

(3)衍生后溶液经过萃取，利用GC-MS/MS在25min内对生物样本中48种游离脂肪酸准确定性、定量分析。

在一个具体的实施例中，其中步骤(1)具体为：向血清样本中加入提取液，所述的提取液由甲醇：MEBE:36％磷酸按体积比为3:4:1组成；振荡3min，上清液吹干，加入200μL15％三氟化硼甲醇溶液，振荡2min，60℃烘箱下保持30min。

在另外一个具体的实施例中，所述步骤(3)的萃取是指：将步骤(1)获得的溶液冷却至室温，加入500μL正己烷，200μL饱和氯化钠溶液，振荡3min，4℃下12000r/min离心2min，取200μL上层溶液，至棕色进样瓶中玻璃内衬管内，用于GC-MS/MS分析。